Virus och celler
Om inget annat anges har alla experiment utförts med ett kliniskt influensavirusisolat i MDCK-celler A/Memphis/14/96-M (H1N1), vänligen tillhandahållet av Dr Robert Webster (St. Jude Children’s Hospital, USA) . De virus som beskrivs i fig. 5 tillhandahölls vänligen av de kollegor som anges i tackorden.
MDCK-celler och MDCK-SIAT1-celler som är stabilt transfekterade med 2,6-sialyltransferas för ökat uttryck av Neu5Ac2-6Gal-terminerade oligosackarider har beskrivits tidigare . Vi förökade båda typerna av celler i DMEM (Gibco) kompletterat med 2 mM L-glutamin, 10 % fetalt kalvserum och antibiotika (streptomycin, 100 mg/ml och penicillin, 100 U/ml).
Overlay media
Som flytande underhållsmedium (MM) för virusinfektion använde vi Eagle’s MEM innehållande L-glutamin, 0,1 % BSA (Sigma, A-0336), antibiotika och 1 μg/ml TPCK trypsin (Sigma, T-1426).
Stocks av 1,8 % Bacto-Agar (BD, 214010) och 2 % metylcellulosa (Methocel MC, 3000-5500 mPa.s vid 2 %, Fluka) i destillerat vatten framställdes enligt tidigare beskrivning .
Hertillverkaren av Avicel RC/CL (FMC BioPolymer) tillhandahöll vänligen tre typer av Avicel (RC-581, RC-591 och CL-661) för testning. Vi framställde stock suspensioner av Avicel genom att dispergera 2,4 g Avicel pulver i 100 ml destillerat vatten på en standard magnetomrörare i 1 timme. Agar, MC och Avicel-lagren steriliserades genom autoklavering i 20 minuter vid 121 °C och förvarades i rumstemperatur.
Overlaysen framställdes genom att blanda lagerlösningar av MC, Avicel eller smält agar med lika stora volymer av underhållsmedium med dubbla styrkor. För att variera koncentrationen av MC och Avicel i överlagringarna spädde vi ut de ursprungliga lagren med sterilt vatten. Agaröverlägget framställdes vid 42-44 °C, två andra överlägg framställdes antingen vid 20 eller 37 °C.
Koncentrerade (2,4 %) Avicel-lagervaror separerade vanligtvis inte under lagringen, utspädda Avicel-baserade överlägg var dock mindre stabila. Om det ansågs nödvändigt blandade vi Avicel stocks, och blandade alltid Avicel overlays före användning genom att antingen skaka med handen eller vortexa. Långsam separation av overlays efter applicering på cellmonolager påverkade inte analysresultaten.
Plaque assay i 6-well-plattor
En timme efter att ha infekterat cellmonolagerna med 30-50 plackbildande enheter av viruset i 1 ml underhållsmedium utan trypsin, avlägsnade vi virusinokulumet, täckte cellerna med 3 ml av de olika overlay-medierna och inkuberade odlingarna vid 35 °C i en atmosfär med 5 % CO2. När det gäller MC- och Avicel-överlagringarna var man noga med att inte störa plattorna under inkubationsperioden för att undvika att det bildades ojämna plack. Efter tre dagars inkubation avlägsnade vi överlagringarna och fixerade cellerna. Agaröverlagret avlägsnades med en metallspatel, MC-, Avicel- och vätskeöverlagren avlägsnades med hjälp av sug. Cellerna fixerades med 4 % paraformaldehydlösning i MEM i 30 minuter vid 4 °C och tvättades med PBS. Alla efterföljande behandlingar av cellerna utfördes vid rumstemperatur. Vi permeabiliserade cellerna och blockerade samtidigt kvarvarande aldehydgrupper genom att inkubera cellerna i 10-20 min med 1 ml/brunn av en lösning innehållande 0,5 % Triton-X-100 och 20 mM glycin i PBS. Vi immunfärgade virusinfekterade celler genom att i 1 timme inkubera monoklonala antikroppar som är specifika för influensa A-virusets nukleoprotein (vänligen tillhandahållet av Dr. Alexander Klimov vid Centers for Disease Control, USA) följt av 1 timmes inkubering med peroxidas-märkta anti-musantikroppar (DAKO, Danmark) och 30 minuters inkubering med utfällningsbildande peroxidas-substrat. En lösning av 10 % normalt hästserum och 0,05 % Tween-80 i PBS användes för beredning av arbetsutspädningar av immunreagens. Vi tvättade cellerna efter de primära och sekundära antikropparna genom att inkubera dem tre gånger i 3-5 minuter med 0,05 % Tween-80 i PBS. Som peroxidasubstrat använde vi antingen färdigt True Blue™ (KPL) eller en lösning av aminoetylkarbazol (AEC, Sigma) (0,4 mg/ml) beredd i 0,05 M natriumacetatbuffert, pH 5,5 och innehållande 0,03 % H2O2. De färgade plattorna tvättades med kranvatten för att stoppa reaktionen och torkades. När det gäller True Blue-färgning, som är relativt instabil i vattenlösningar, torkades plattorna inverterat för att minimera blekningen. Färgade plattor skannades på en flatbäddsskanner och data förvärvades med programvaran Adobe Photoshop 7.0.
Som ett alternativ till immunfärgning avslöjade vi i vissa experiment plack som områden med förstörda celler. För detta ändamål färgade vi, efter att ha tagit bort överlagringarna, cellerna med 1 % kristallviolettlösning i 20 % metanol i vatten.
Varianter av virustitrering i 96-brunnsplattor
1. Standardvariant
Vi infekterade MDCK- eller MDCK-SIAT1-cellmonolager i 96-hålsplattor med 50 μl/hål av seriella utspädningar av viruset i underhållsmedium utan trypsin. Efter 1 h inkubation vid 35 °C i 5 % CO2 avlägsnade vi viruset, tillsatte 100 μl/well av antingen MC- eller Avicel-överlagringsmedia och inkuberade cellerna i ytterligare 24 h för att möjliggöra plackbildning. Fixering och immunfärgning utfördes enligt beskrivningen ovan för 6-brunnsplattor men med användning av 50 μl reagenser per brunn.
2. Förenklad variant
Testet utfördes exakt som i standardvarianten med följande ändringar. Efter 1 h inkubation med viruset tog vi inte bort inokulumet. Vi tillsatte 100 μl/brunn av Avicel overlay media och blandade plattan antingen genom att knacka med handen eller med hjälp av en plattblandare. Medierna innehöll ökade mängder trypsin (1,5 μg/ml) för att kompensera för utspädningen av overlay med det virusinnehållande material som fanns i brunnarna.
Plaque inhibition assay
Noel Roberts (Roche Products, UK) tillhandahöll vänligen neuraminidashämmaren oseltamivirkarboxylat (OC). Vi tillsatte 50 μl/brunn av seriella 10-faldiga utspädningar av OC i underhållsmedium utan trypsin (koncentrationsintervall från 4 nM till 400 μM OC) till monolager av MDCK-SIAT1-celler i 96-brunnsplattor. Vi tillsatte sedan 50 μl/brunn av virusutspädningar (20-40 plackbildande enheter per brunn). Vi blandade plattan och inkuberade den i 1 timme vid 35 °C för att möjliggöra initiering av virusinfektion. Därefter tillsatte vi 100 μl/brunn av 1,2 % Avicel overlay media innehållande 2 μg/ml trypsin, inkuberade kulturerna i 24 h och fixerade och immunfärgade dem enligt beskrivningen ovan.
I fallet med 6-brunnsplattor tillsatte vi 0,75 ml alikvot av läkemedlet och inhibitorn och 1,5 ml alikvot av Avicel per brunn och immunfärgade plackerna 3 dagar efter infektion.