- Hypoxi orsakar en ökning av uttrycket av M. smegmatis recA- och recX-gener
- Konstruktion av ΔrecX- och ΔrecA ΔrecX-mutantstammar
- Genotypisk och fenotypisk analys av M. smegmatis ΔrecX- och ΔrecAΔrecX-mutanter
- M. smegmatis ΔrecA- och ΔrecA ΔrecX-mutantstammarna uppvisar försämrad tillväxt och minskad cellavkastning i förhållande till vildtypstammen
- Deletion av recA, men inte recX, gör M. smegmatis mer mottaglig för DNA-skadliga agenter
- Överlevnad efter behandling med olika koncentrationer av DNA-skadande ämnen
- Uttrycket av recA- och recX-gener induceras av DNA-skador
- Slutsatser
- De förkortningar som används är
Hypoxi orsakar en ökning av uttrycket av M. smegmatis recA- och recX-gener
Under infektions- och proliferationsförloppet utsätts M. tuberculosis för fysiologiska stressförhållanden som hypoxi och sur pH-stress, vilket kan äventyra dess överlevnad38,39,40. Akut hypoxisk stress stoppar till exempel DNA-replikationen och utlöser robusta DNA-skador41,42,43. En ökning av uttrycket av gener i SOS-vägen, inklusive umuDC, polB, recN, sulA, uvrA, uvrB och uvrD, börjar vid DNA-skada44,45,46. I detta syfte har hypoxiinducerad genuttrycksprofilering i M. smegmatis och M. tuberculosis under latent infektion gett värdefulla insikter om karaktären hos latenta tuberkelbaciller och dess behandling47.
Premiärstudier i M. tuberculosis48, Thiobacillus ferrooxidans49 och Streptomyces lividans50 har visat att recA samtranskriberas med recX. Vidare visade sig ett överuttryck av RecA (en positiv regulator av SOS-svaret) vara giftigt i avsaknad av RecX i vissa bakteriearter, däribland Pseudomonas aeruginosa51, S. lividans50, M. smegmatis52 och Xanthomonas oryzae53. Dessa resultat stämmer överens med uppfattningen att RecX fungerar som ett anti-rekombinas för att stoppa olämpliga rekombinationshändelser som främjas av RecA14. Däremot är ett överuttryck av RecA i E. coli ΔrecX-stammen inte skadligt och borttagning av recX påverkar inte recA-uttrycket54. RecX-transkriptionen i E. coli nedregleras jämfört med recA under normala tillväxtförhållanden på grund av att det finns en transkriptionstermineringsplats mellan recA- och recX-kodningssekvenserna. Ett recA-recX mRNA-transkript som är resultatet av transkriptionell read-through ackumuleras dock i storleksordningen 5-10 % av det totala recA mRNA-innehållet54. RecX-transkriptet var knappt påvisbart under den vegetativa tillväxten av E. coli, men ett robust uttryck av recX uppträder efter behandling med DNA-skadande ämnen15,55.
Den genomiska strukturen hos både M. smegmatis och M. tuberculosis innehåller en enda kopia vardera av recA och recX i ett enda operon. För att undersöka uttrycket och regleringen av dessa gener under aerob och hypoxisk tillväxt i M. smegmatis, en vanligen använd surrogatmodell för M. tuberculosis, mättes den relativa abundansen av mRNA i olika tillväxtfaser med en RT-qPCR-analys och normaliserades till den konstitutivt uttryckta 16S rRNA-genen. Ct-värdena (cycle threshold) för M. smegmatis recA- och recX-mRNA normaliserades mot Ct-värdet för 16S rRNA-genen. I motsats till E. coli15,55 sågs en betydande mängd recA mRNA-transkriptioner i tidig logfas under både aeroba och hypoxiska odlingsförhållanden (fig. 1A). Intressant nog ökade hypoxiska förhållanden ackumuleringen av recA mRNA med 1,5 gånger i mitten av logfasen och minskade därefter när cellerna gick in i den stationära fasen. Ett liknande mönster observerades med recX mRNA-abundans under både aeroba och hypoxiska förhållanden, om än på minskade nivåer (fig. 1B). Dessa observationer stöder idén att de två generna samtranskriberas och regleras samordnat under aeroba och hypoxiska tillväxtförhållanden. Intressant nog sågs ingen skillnad i mängden mRNA under aeroba och hypoxiska tillväxtförhållanden i den tidiga logfasen. Transkriptionsprofilerna för M. smegmatis tillväxtfas-specifika markörgener (sigH2 och sigH7)56 användes för att fastställa tidpunkterna för den tidiga logfasen, den mellersta logfasen och den stationära fasen (fig. 1C). I multiresistenta kliniska stammar av M. tuberculosis visade sig nivåerna av både recA- och recX-mRNA vara högre än i de läkemedelskänsliga stammarna och nivåerna av recX-mRNA ökade samtidigt med en ökning av recA-mRNA57.
(A,B) Relativa nivåer av uttrycket av M. smegmatis mc2155 recA- och recX-gener vid tidig log-, mellan-log- och stationärfasen under aeroba och hypoxiska tillväxtförhållanden. (C) Relativa uttrycksnivåer för generna sigH2 och sigH7 i den tidiga log-, mid-log- och stationära fasen. Signalintensiteterna bestämdes enligt beskrivningen i avsnittet Metoder. Histogrammen representerar medelvärdena för tre oberoende experiment. Uttrycksnivåerna bestämdes och normaliserades till uttrycket av 16S ribosomalt RNA och induktionskvoterna beräknades i förhållande till mängden transkript i den aeroba kulturen i tidig logfas. Felstaplarna representerar standardfelet för medelvärdet beräknat från tre oberoende replikat.
Det bör dock noteras att mRNA-nivåerna inte kan användas som surrogat för motsvarande proteinnivåer. Därför mättes förekomsten av RecA- och RecX-proteiner i M. smegmatis under aeroba och hypoxiska förhållanden genom en Western blot-analys med anti-RecA- och anti-RecX-antikroppar. GroEL undersöktes som en kontroll för proteinbelastning. Den densitometriska analysen av immunoblots visade att cellerna ackumulerade högre nivåer av RecA under hypoxiska tillväxtförhållanden jämfört med aeroba förhållanden (fig. 2A, B). En jämförande analys visade att cellerna konsekvent ackumulerade 2 gånger högre nivåer av RecA i mitten av logfasen jämfört med den tidiga logfasen under aeroba tillväxtförhållanden, vilket minskade i den stationära fasen till nivåer som sågs i den tidiga logfasen (Fig. 2A,B). Ett liknande mönster observerades för RecX, även om nivåerna var mindre uttalade än för RecA (fig. 2A,C). Även om mRNA- och proteinuttrycksmönstren var jämförbara noterades viktiga skillnader. För det första kunde RecX-proteinet knappt påvisas i tidig logfas under hypoxiska förhållanden. För det andra var abundansen av RecA mRNA och protein högre jämfört med RecX.
(A) Uttrycksmängder av M. smegmatis mc2155 RecA- och RecX-proteiner under aeroba och hypoxiska tillväxtförhållanden. (B) Kvantifiering av relativa förändringar i RecA-proteinnivåerna under aeroba och hypoxiska tillväxtförhållanden. (C) Kvantifiering av relativa förändringar i RecX-nivåer under aeroba och hypoxiska tillväxtförhållanden. Histogrammen representerar medelvärdena bestämda genom kvantifiering av Western Blots från tre oberoende experiment. Belastningskontrollen GroEL användes för normalisering av RecA- och RecX-uttrycksnivåerna. Felstaplarna representerar standardfelet för medelvärdet beräknat från tre oberoende upprepningar. Signifikanta skillnader anges med **p < 0,01 och *p < 0,05. ns, ej signifikant.
Och även om dessa resultat antyder att M. smegmatis recA- och recX-gener induceras under hypoxiska förhållanden finns det ingen korrelation mellan mängden recX mRNA och motsvarande protein i den tidiga logfasen. Både M. tuberculosis och M. smegmatis har visat sig stabilisera sina mRNA-transkriptioner under tillväxthämmande förhållanden58,59,60. Bland möjliga mekanismer har tRNA-omprogrammering och selektiv kodon-biased translation visat sig spela en roll i mykobakterier som svar på hypoxi61. En möjlig förklaring till bristen på korrelation mellan recX mRNA- och proteinnivån i den tidiga logfasen kan bero på translationell repression av recX mRNA.
Konstruktion av ΔrecX- och ΔrecA ΔrecX-mutantstammar
Den skillnad som finns mellan RecA- och RecX-proteinnivåerna i M. smegmatis tyder på en möjlig reglering av genuttrycket på transkriptionsnivå. I många bakterier som hittills studerats är recX-genen belägen på samma kodande sträng nedströms från recA och de två generna samtranskriberas48,50,53,54,62,63. I Xanthomonas pathovars lexA-recA-recX-locus uttrycks dock varje gen från sin egen promotor64. I D. radiodurans65,66, B. subtilis67 och N. gonorrhoeae26 är dessutom recA- och recX-generna åtskilda med flera hundra kb och transkriberas från sina egna promotorer.
I ett antal mykobakteriearter, liksom i ett fåtal andra bakterier, överlappar 5′-regionen av recX-kodningssekvensen 3′-regionen av recA-genen. Överlappningen är 32 bp lång i M. smegmatis48 , medan den i M. tuberculosis68 och M. leprae69 är 35 bp lång. Effekten av recX-deletion på de fenotypiska egenskaperna har studerats i olika organismer7,10. Knockoutmutanter av recX uppvisar en rad fenotyper som är förknippade med RecA-funktioner: inaktivering av B. subtilis recX gjorde cellerna känsliga för MMS och H2O225, S. lividans recX-mutanter uppvisade minskad motståndskraft mot UV-skador42 och N. gonorrhoeae recX-mutanten uppvisade en liten minskning av sin förmåga att överleva DNA-skador som orsakades av dubbelsträngsbrott26. Effekten av deletion av både recA- och recX-gener på tillväxtegenskaperna och reparation av DNA-skador har dock inte undersökts i någon organism. Dessutom är en fullständig förståelse av recX:s roll in vivo i mykobakterier inte helt klarlagd.
Förra studier har visat att M. smegmatis ΔrecA-stammen uppvisade känslighet för UV-inducerad DNA-skada och misslyckas med att främja HR52. Vi kombinerade recA-mutationen med deletion av recX för att undersöka effekterna av de dubbla mutationerna. För detta ändamål genererades M. smegmatis mc2155 recX single och recArecX double mutant stammar. Som en kontroll utvärderades effekten av recA-deletion i M. smegmatis på nytt för en direkt jämförelse. Med hjälp av rekombinationsmetoden, som bygger på ett protokoll som utvecklats för M. tuberculosis och M. bovis BCG28, genererades M. smegmatis mc2155 ΔrecA- och ΔrecAΔrecX-mutanter med hjälp av 3,279 kb och 3,302 kb linjära ΔrecA::hyg- respektive ΔrecAΔrecX::hyg AES-konstruktioner. Ungefär 100 ng linjära AES-DNA-fragment genererades genom restriktionsspjälkning av respektive plasmider med EcoRV (fig. 3A). Dessa transformerades till kompetenta M. smegmatis mc2155:pJV53-rekombinationsceller70. Efter 4-5 dagars inkubation hittades 8-10 Hyg-resistenta kolonier för ΔrecX- och ΔrecAΔrecX-mutanterna. De förmodade mutantstammarna screenades med hjälp av PCR för att avgöra om recX- och recArecX-generna var borttagna från kromosomen (data visas inte). De korrekta mutanterna odlades i 7H10 Middlebrook agarmedium i 5-8 generationer för att möjliggöra förlust av pJV53.
Isolering av M. smegmatis mc2155 ΔrecX- och ΔrecA ΔrecX-mutantstammar. (A) Fysisk karta över M. smegmatis recA recX-, ΔrecAΔrecX- och ΔrecX-regionerna. De horisontella linjerna med pilspetsar i båda ändarna representerar storleken på det genomiska DNA-fragmentet mellan NdeI- och SalI-restriktionsplatserna som motsvarar vildtypen, ΔrecA ΔrecX och ΔrecX-stammarna. Blixtbultsymbolerna anger igenkänningsställen för de angivna restriktionsenzymerna. De små svarta rutorna (intill NdeI-igenkänningsstället) anger hybridiseringssonder som används i Southern blotting-experiment. (B) Southern blot-analys av genomiskt DNA från vildtyp- och ΔrecX-stammar. Lane 1 och 4, molekylviktsmarkörer; 2, genomiskt DNA från vildtypstammen; 3, genomiskt DNA från ΔrecX-stammen. (C) Southern blot-analys av genomiskt DNA från vildtypstammar och ΔrecAΔrecX-stammar. Lane 1, molekylära viktmarkörer; 2, genomiskt DNA från vildtypstammen; 3, genomiskt DNA från ΔrecAΔrecX dubbelmutantstammen.
Genotypisk och fenotypisk analys av M. smegmatis ΔrecX- och ΔrecAΔrecX-mutanter
Efter screening med PCR erhölls två vardera ΔrecX- och ΔrecAΔrecX knockout-mutanter av M. smegmatis mc2155. ΔrecX- och ΔrecAΔrecX-mutanterna karakteriserades genom restriktionsenzymkartläggning och Southern blot-hybridisering (fig. 3). Vid hybridisering med lämpliga radiomärkta prober sågs ett 4,1 kb-fragment hos celler av vildtyp M. smegmatis mc2155. De förutspådda fragmenten på 3,14 kb och 2,09 kb observerades i ΔrecX- respektive ΔrecAΔrecX-mutanter (fig. 3B,C). Båda dessa band är mindre än 4,1 kb, vilket tyder på att recX- och recArecX-generna har tagits bort genom allelisk ersättning. Frekvensen av allelutbyte med avseende på recX och recArecX låg i intervallet 70 % respektive 80 %.
En invändning mot denna analys är att de observerade effekterna av ΔrecX- och ΔrecAΔrecX-mutationer kan bero på polära effekter av insättning av genen för hygromycinresistens. Generellt sett kan genetiska förändringar runt recA-recX-lokus leda till polära effekter på uttrycket av gener nedströms från recA-recX-lokus. Två oberoende experiment genomfördes för att undersöka de potentiella polära effekterna. Först kompletterades ΔrecX- och ΔrecAΔrecX-mutanterna med funktionella kopior av recA- och recX-generna. Transformanterna utvärderades med avseende på deras förmåga att växa i ett standardkulturmedium och skydda mutantcellerna mot UV-strålning. Tiofaldiga serieutspädningar spottades på 7H10-agarplattor och analyserades. Som framgår av figur 4A,B kompletterade vildtypen recA delvis ΔrecA- och ΔrecAΔrecX-mutantstammarna, vilket framgår av deras förmåga att stödja tillväxt och ge skydd mot UV-strålning. Wild-type recX lyckades dock inte rädda fenotypen hos ΔrecAΔrecX-mutantstammarna som observerades vid induktion av DNA-skador med UV-strålning. Eftersom borttagning av recX inte hade någon märkbar effekt på tillväxten under normala och DNA-skadande förhållanden, uppvisade ΔrecX och motsvarande kompletterade stam liknande tillväxt som vildtypen.
Insertion av en hygromycinresistensgen i M. smegmatis mc2155 recA-recX locus utövar ingen polär effekt. precA och precX betecknar pVV16-vektor med en funktionell kopia av antingen recA- eller recX-genen under kontroll av den konstitutiva Hsp60-promotorn. EV betecknar pVV16 tom vektor. precA och precX betecknar plasmider som bär vildtypkopior av M. smegmatis recA- respektive recX-gener. Dessa har transformerats till de angivna vildtyp- och mutantstammarna. Komplettering av M. smegmatis mc2155ΔrecA ΔrecX- och ΔrecX-mutantstammar för aerob tillväxt (panel A) och känslighet mot UV-strålning (panel B) med plasmider som bär vildtypsalleler av M. smegmatis recA eller recX. (C), kvantitativ realtids-PCR-analys av gener runt recA-recX-lokuset i M. smegmatis mc2155 vildtyp och mutantstammar. Felstaplarna representerar standardfelet för medelvärdet beräknat från tre oberoende upprepningar. Signifikanta skillnader anges med ns, ej signifikant.
För det andra bedömde vi uttrycket av två M. smegmatis mc2155-gener, gluD (MSMEG_2725) och glnH (MSMEG_2726), som ligger nedströms från recA recX-lokusen i ΔrecA ΔrecX- och ΔrecX-mutantstammarna jämfört med vildtypstammen. M. smegmatis hyd2-genen (MSMEG_2720) som ligger uppströms från recA-recX-lokuset användes som en positiv kontroll. Det totala RNA:t framställdes från vildtypen, ΔrecA ΔrecX och ΔrecX-mutantstammarna. Den relativa abundansen av genernas transkript bestämdes genom kvantitativ RT-qPCR och normaliserades till den konstitutivt uttryckta kromosomala 16S rRNA-genen. Uttrycksnivåerna mättes från celler som växte i den sena exponentiella tillväxtfasen. I samtliga fall var genuttrycksprofilerna för både uppströms- och nedströms-ORF:erna likartade för vildtyp- och mutantstammarna (fig. 4C). Sammantaget utesluter dessa resultat möjligheten att insättning av hygromycinresistensgenen orsakar polära effekter.
M. smegmatis ΔrecA- och ΔrecA ΔrecX-mutantstammarna uppvisar försämrad tillväxt och minskad cellavkastning i förhållande till vildtypstammen
För att karakterisera M. smegmatis ΔrecX- och ΔrecA ΔrecX-mutantstammar mättes tillväxtprofilerna för vildtypstammarna och knockoutstammarna i 7H9 Middlebrook-buljong vid 37 °C (fig. 5). RecX-deletionen hade ingen märkbar effekt (jämfört med vildtypstammen) på tillväxten av M. smegmatis. Under liknande förhållanden ökade recA-deletionen markant längden på fördröjningsfasen och minskade samtidigt den exponentiella tillväxtfasen, vilket tyder på att recA spelar en roll för tillväxten och livskraften hos M. smegmatis. Dessutom stämmer dessa resultat överens med RecA:s kända funktion vid räddning av avstannade eller kollapsade replikationsgafflar71,72,73. Eftersom recA- och recX-generna bildar ett enda operon undersöktes effekten av deras deletion på M. smegmatis tillväxt. ΔrecA ΔrecX knockout-stammen uppvisade en tillväxtfenotyp som låg mellan ΔrecA-mutanten och vildtypstammen, men tillväxten vid sena log- och stationära faser var likartad den hos ΔrecA- och vildtypstammar.
Kinetiken för tillväxten av M. smegmatis mc2155 vildtyp, ΔrecA och ΔrecA ΔrecX och ΔrecX stammar under normala tillväxtförhållanden. Varje datapunkt är medelvärdet av tre oberoende experiment och felstaplarna representerar standardavvikelser för medelvärdena.
Deletion av recA, men inte recX, gör M. smegmatis mer mottaglig för DNA-skadliga agenter
I likhet med andra eubakterier spelar det mykobakteriella RecA-proteinet en avgörande roll för att reglera SOS-svaret vid DNA-skada74,75,76,77. För att testa om avsaknaden av recArecX och recX påverkar M. smegmatis förmåga att effektivt reparera skadat DNA utsattes mutanterna för en rad medel med varierande mekanismer för DNA-skador. I dessa experiment inducerades stress genom att utsätta ΔrecA-, ΔrecX- och ΔrecA ΔrecX-mutantstammarna för UV-strålning, MMS, H2O2 eller ciprofloxacin under den exponentiella fasen (OD600 på 0,6) av bakterietillväxten. Efter 3 timmars inkubation tvättades cellerna och deras livsduglighet testades genom att man spottade tiofaldiga serieutspädningar av kulturerna på Middlebrook 7H10-agarplattor som innehöll hygromycin (100 µg/ml). Den lämpligaste koncentrationen/dosen av de DNA-skadande ämnena fastställdes efter utvärdering av skillnaderna i cellviabilitet mellan stammarna med hjälp av plattanalyser. I avsaknad av DNA-skadande medel uppvisade alla stammar liknande nivåer av cellviabilitet (fig. 6). I närvaro av DNA-skadande medel uppvisade däremot ΔrecA-stammen en uttalad tillväxtdefekt som åtföljdes av en 100-faldig minskning av pläteringsförmågan i förhållande till vildtypstammen. Denna fenotyp överensstämmer med den tillgängliga litteraturen. Däremot blockerades den dödliga effekten av UV, MMS eller ciprofloxacin, men inte H2O2, delvis av deletion av recX-genen i ΔrecA-stammen. Även om grunden för avsaknaden av H2O2-effekt inte är klar, var den använda koncentrationen troligen inte tillräckligt hög för att påverka tillväxten. Intressant nog uppvisade ΔrecX-stammen en något mer resistent fenotyp mot alla fyra DNA-skadande ämnen än ΔrecA ΔrecX-stammen, vilket tyder på en möjlig funktionsökning på grund av förlusten av recX-genen. Med tanke på dessa resultat är det uppenbart att recA spelar en aktiv roll i SOS-svaret och att känsligheten för DNA-skadande ämnen är något nedsatt i ΔrecX-stammen.
Effekt av DNA-skadande ämnen på överlevnaden hos M. smegmatis mc2155 vildtyp och ΔrecA-, ΔrecA ΔrecX- och ΔrecX-stammar. Plattorna utsattes för: (A) fem J/m2 UV-ljus, (B) 0,01 % MMS, (C) 1 mM H2O2 och (D) 5 μM ciprofloxacin. Kontrollen representerar tillväxten av stammar utan något DNA-skadande medel. Resultaten är representativa data (n = 3) från tre oberoende experiment.
Överlevnad efter behandling med olika koncentrationer av DNA-skadande ämnen
Mykobakterier utsätts för ett antal ogynnsamma stressförhållanden, t.ex. oxidativ, näringsmässig och läkemedelsinducerad stress78,79,80,81,82. För att ytterligare utforska skillnaderna i cellviabilitet genomfördes experiment där cellviabiliteten mättes med hjälp av kolonibildande enheter (CFU). Först testades livskraften hos M. smegmatis mc2155 ΔrecA-, ΔrecX- och ΔrecAΔrecX-mutanter i jämförelse med vildtypen genom att utmana dem med ökande koncentrationer av MMS. Stammarna odlades i närvaro av angivna koncentrationer av MMS tills kulturerna nådde en OD600 på 0,6. Cellens livsduglighet testades genom att plotta ut ett förutbestämt antal celler på 7H10-agarplattor. Cellerna bedömdes vara levande om de kunde dela sig och bilda kolonier. Mutanterna visade, till skillnad från vildtypstammen, ökad känslighet för MMS på ett koncentrationsberoende sätt. Den kvantitativa analysen visade att ΔrecA-mutanten uppvisade en relativt högre känslighet för MMS, som ökade med ökande koncentrationer av MMS (fig. 7A). När det gäller ΔrecX var cellerna ~2 gånger mindre känsliga för MMS jämfört med ΔrecA-cellerna. Å andra sidan visade ΔrecA ΔrecX-mutanten större känslighet för MMS i motsats till ΔrecX-mutanten. ΔrecX-mutantens känslighet för MMS tyder på att recX kan ha ännu oidentifierade mål utöver RecA. Detta antagande behöver undersökas ytterligare.
Överlevnad av kulturer i exponentiell fas som utsätts för ett brett spektrum av ökande koncentrationer av DNA-skadande ämnen. Överlevnaden av M. smegmatis vildtyp, ΔrecA, ΔrecA ΔrecX och ΔrecX-stammar undersöktes genom att bestämma antalet CFU. (A) Överlevnad av celler som behandlats med (A) MMS, (B) H2O2, (C) UV-strålning och (D) ciprofloxacin. Felstaplarna representerar standardfelet för medelvärdet beräknat från tre oberoende upprepningar. Signifikanta skillnader anges med *p < 0,05; **p < 0,01 och ***p < 0,001. ns, ej signifikant.
Nästan, känsligheten hos M. smegmatis mc2155 ΔrecA, ΔrecX och ΔrecA ΔrecX-mutantstammarna i förhållande till vildtypstammen bestämdes genom att utsätta dem för ökande koncentrationer av H2O2. Resultaten visar att ΔrecA-mutanten var mindre känslig för denna behandling (fig. 7B). Deletion av enbart recX, eller deletion av recA-recX-lokuset, hade endast en mindre effekt på mutantcellernas livskraft och proliferation som svar på H2O2-behandling. Noterbart är att ΔrecA- och ΔrecAΔrecX-mutantstammarna uppvisade en känslig tillväxtfenotyp för UV-strålning och ciprofloxacin som är betydligt mycket allvarligare än för MMS eller H2O2 (fig. 7C,D). Dessutom uppvisade ΔrecA-stammen större känslighet för UV-strålning och ciprofloxacin än ΔrecA ΔrecX dubbelmutantstammen.
Uttrycket av recA- och recX-gener induceras av DNA-skador
De regulatoriska elementen uppströms recA-genen är inte bevarade i alla mykobakteriella arter. Till exempel transkriberas recA-genen i M. tuberculosis från två promotorer: båda är DNA-skadeinducerbara, om än genom olika mekanismer. Promotorn P1 för M. tuberculosis recA (närmast startkodonet) kan induceras efter DNA-skador oberoende av LexA- och RecA-proteinerna. Promotorn P2 (som ligger långt från recA-startkodonet) regleras däremot av LexA, vilket är funktionellt analogt med E. coli recA-promotorn83,84,85. Intressant nog är mekanismen för induktion av DNA-skador i M. tuberculosis inte helt bevarad i M. smegmatis46,75. Dessa fynd understryker behovet av att förstå uttrycket och regleringen av M. smegmatis recA- och recX-gener och deras roll som svar på DNA-skadande ämnen.
Som beskrivits ovan orsakade hypoxi en ökning av uttrycket av M. smegmatis recA- och recX-gener (fig. 1). För att ytterligare bekräfta uppfattningen att uttrycket av M. smegmatis recA- och recX-gener är skadeinducerbart bestämdes kinetiken för induktion med och utan DNA-skada med hjälp av RT-qPCR. Totala RNA-prover framställdes från M. smegmatis-celler som skördats 0, 3, 6, 9 och 12 timmar efter exponering för UV-ljus samt från obehandlade kulturer och analyserades enligt beskrivningen i avsnittet Metoder. Resultaten visade inga signifikanta skillnader mellan recA- och recX-transkriptnivåerna i obehandlade celler. Däremot observerades en markant ökning av recA- och recX mRNA-transkriptionerna 3 timmar efter exponering för UV-strålning, för att sedan minska något därefter. En jämförelse av RT-qPCR-data visar på viktiga skillnader mellan recA- och recX-transkriptnivåerna. Exponering för UV-strålning ledde till en ~8-faldig ökning av recA mRNA jämfört med kontrollen, medan recX med ~3-faldig (fig. 8A,B). Även om recA- och recX-mRNA existerar i samma transkriptionella enhet stöder dessa resultat således tanken att produktionen och/eller stabiliteten av recX mRNA-transkriptet är föremål för en ytterligare posttranskriptionell regleringsmekanism.
UV-strålning inducerar uttrycket av recA och recX i M. smegmatis. (A) kinetik för ackumulering av recA mRNA i kontroll och efter exponering för UV-strålning; (B) kinetik för ackumulering av recX mRNA i kontroll och efter exponering för UV-strålning. (C) Representativa västerblottar som visar kinetiken för ackumulering av RecA- och RecX-proteiner i kontrollerade och UV-inducerade M. smegmatis-celler. (D,E) Kvantifieringar av Western blot-data som visas i panel C. Felstaplarna representerar standardfelet av medelvärdet beräknat från 3 oberoende replikat.
Dessa resultat ledde till att vi utförde ytterligare experiment för att bestämma kinetiken för ackumulering av RecA- och RecX-proteiner i M. smegmatis-celler med eller utan DNA-skada. Western blotting-analyser utfördes på hela celllysat med hjälp av polyklonala antikroppar som uppkommit mot RecA och RecX (fig. 8C). Kvantifieringen av Western blots visade att cellerna innehöll betydande mängder av både RecA- och RecX-proteiner i oinducerade celler (fig. 8D,E). Som jämförelse sågs en 2-faldig ökning av förekomsten av både RecA och RecX (jämfört med kontroll) i cellerna 3 timmar efter exponering för UV-strålning och minskade därefter. Viktigt är att induktionen av RecA- och RecX-proteiner uppvisade ett mönster som påminde om det som sågs i celler under hypoxiska förhållanden (fig. 2), även om de mekanismer genom vilka de skadar DNA sannolikt är annorlunda.
Slutsatser
Antaliga studier har visat att recA och recX utför ett brett spektrum av funktioner som är relaterade till DNA-reparation och rekombination7,10. Såvitt vi vet har de stimuli som aktiverar uttrycket av M. smegmatis recA- och recX-gener inte identifierats. I den här studien bedömdes uttrycksnivåerna för dessa gener i celler vid aerob tillväxt och som svar på olika stressförhållanden. I M. smegmatis, i likhet med många bakteriearter, tillhör recA och recX samma operon, och recX-genen är belägen omedelbart nedströms från recA-genen och delar överlappande kodningsregioner86. Man fann att DNA-skadande ämnen inducerade uttrycket av båda generna i olika omfattning, men uttrycksförhållandena följer ett liknande mönster. Intressant nog förblir nivåerna av både RecA och RecX höga under stressförhållanden jämfört med aeroba tillväxtförhållanden.
Flera studier har visat på alternativa roller för recX i den rekombinationella DNA-reparation som främjas av RecA. Medan RecX-proteinet fysiskt interagerar med RecA och fungerar som en potent hämmare av alla kända funktioner hos den senare i många bakteriearter14,46,48, potentierar det homolog rekombination i N. gonorrhoeae och B. subtilis25,26. För att få en inblick i recX:s roll i stressresponsen hos mykobakterier konstruerades knockoutmutanter av M. smegmatis recX och recArecX. Intressant nog resulterade borttagningen av recX i M. smegmatis i en något mer resistent fenotyp mot alla fyra DNA-skadliga ämnen, vilket tyder på en möjlig funktionsförstärkning på grund av förlusten av recX-genen. Den molekylära grunden för denna effekt är inte klar, vilket är värt att utforska i framtida studier. Även om vår analys huvudsakligen var inriktad på den genetiska interaktionen mellan recA och recX i den rekombinationella DNA-reparationsvägen, verkar recX intressant nog spela en viktig roll för bakterietillväxten. Sammanfattningsvis stämmer dessa resultat överens med tanken att M. smegmatis recX spelar en viktig roll i DNA-reparation/rekombinationsprocesser under ogynnsamma förhållanden, kanske genom att reglera de skadliga effekterna av en delmängd av de ännu okända generna.
De förkortningar som används är
DTT, dithiothreitol; EDTA, etylendiamintetraättiksyra; kb, kilobas; MMS, metylmetansulfonat; ODN, oligonukleotid; PAGE, polyakrylamidgelelektrofores; PVDF: polyvinylidendifluoridmembran. RT-qPCR: kvantitativ polymeraskedjereaktion med omvänd transkription. SDS: natriumdodecylsulfat. ssDNA: enkelsträngat DNA.15 M NaCl-0,015 M natriumcitrat (pH 7,0) buffert.