Practice for Human Genetics Vienna

Genomövergripande sökning efter mikroaberrationer: Array-CGH

Komplexa syndrom baserade på multiplikation eller reduktion av kromosomalt material har länge varit kända. Vid trisomi 21, till exempel, finns en komplett kromosom tre gånger i stället för två. Vid mikrodeletionssyndrom som Williams-Beuren-, Prader-Willi- eller Smith-Magenis-syndrom saknas mer eller mindre definierade delar av en kromosom, vanligen på en submikroskopisk skala på några megabaser. När det gäller monogenetiska sjukdomar har deletioner eller duplikationer av enskilda gener eller gensegment nyligen upptäckts allt oftare som orsaken till sjukdomen.

De tekniker som hittills har använts för att diagnostisera sådana förändringar i gendoseringen har sina begränsningar: Även om molekylärcytogenetiska metoder som FISH eller molekylärgenetiska metoder som MLPA kan användas med hög eller högsta upplösning måste de på förhand veta eller anta vilket område av genomet som påverkas. Å andra sidan kan klassisk cytogenetik eller CGH-tekniken (”komparativ genomisk hybridisering”) användas: Jämförande hybridisering av patient- och referens-DNA på metafasekromosomer) kan täcka hela genomet, men upplösningen är i bästa fall begränsad till cirka 5 Mb på grund av användningen av ljusmikroskop.

För att övervinna dessa begränsningar i de befintliga teknikerna är array-CGH ett lämpligt alternativ.

Här kombineras den konventionella CGH-tekniken med erfarenheterna från uttrycksanalyser med hjälp av mikroarrayer: Definierade DNA-fragment som är immobiliserade på ytan av ett glasobjektiv tjänar som hybridiseringsmål, där termen ”array” hänvisar till det regelbundna, rutnätsliknande arrangemanget av dessa fragment. Fragmenten väljs ut för att täcka det mänskliga genomet så jämnt som möjligt.

För analysen samhybridiseras ungefär lika stora mängder av patientens DNA och ett referensgenomiskt DNA på matrisen. Eftersom patient- och referens-DNA-proverna är märkta med olika fluorescerande färgämnen leder en numerisk förändring i patientens arvsmassa till en färgförskjutning i den fluorescerande signalen för enskilda fragment via en förskjutning i hybridiseringsförhållandet.

Skematisk bild av array-CGH-tekniken:

I skannern registreras de fluorescerande signalerna och färgförskjutningarna. Med hjälp av lämplig programvara tilldelas signalerna till genregionen och slutligen kan resultatet visas, t.ex. som ett ”karyogram”, som visar vid vilken punkt på en kromosom förändringar förekommer.

Display av ett resultat av array-CGH: duplikation av regionen Xp11-p21.1 (skapad vid ZMG med CGHAnalytics, Agilent)

Antalet och tätheten av fragmenten på arrayen bestämmer upplösningen av array-CGH. För närvarande finns det arrayer som täcker hela det mänskliga genomet med upplösningar som sträcker sig från 1 Mb ner till cirka 35 kb. På grund av det ständigt ökande antalet fragment per array kommer upplösningen att fortsätta att öka. På så sätt kan obalanser i enskilda gener upptäckas på ett tillförlitligt sätt.

Användningar av array CGH

Array CGH är alltså en teknik där en patients hela arvsmassa kan undersökas med hög upplösning för att hitta avvikelser från normal gendosering. Den blir allt viktigare som en innovativ screeningmetod, även om den först användes främst för tumördiagnostik. Detta beror på att tumörutveckling kännetecknas av en ackumulering av aberrationer som kan åtföljas av amplifiering av onkogener och deletion av tumörsuppressorgener.

ArrayCGH är av särskilt intresse för diagnostik av fall av oförklarlig mental retardation. Vid standardcytogenetik är avvikelser synliga i cirka 5 % av fallen hos patienter med mental retardation och ytterligare tecken på dysmorfi eller familjär klusterbildning. Subtelomerscreening med FISH eller MLPA kan hitta en orsak i ytterligare 5 % av fallen. Nya studier visar att array-CGH med en upplösning på cirka 1 Mb avslöjar genomiska obalanser hos 10-15 % av patienterna med en oansenlig karyotyp och negativa subtelomerfynd. (se litteratur). Det antas att denna detektionsfrekvens kommer att öka i takt med att upplösningen på matriserna ökar. Vissa forskargrupper rekommenderar redan array CH som det första diagnostiska steget vid oförklarlig mental retardation.

Array CH upptäcker dock inte bara nya obalanser, utan kan också användas för att exakt fastställa storleken på deletionen, brottpunkternas placering eller ursprunget till det extra materialet vid cytogenetiskt synlig förlust eller ökning av kromosomala regioner. Detta är viktigt för en korrekt genotyp-fenotypkorrelation och för att identifiera kandidatgener som är involverade i utvecklingen av MR och dysmorfi. I vissa kromosomala avvikelser som tidigare befunnits vara ”balanserade” translokationer har Array CGH kunnat visa att genetiskt material har tagits bort eller duplicerats i området kring brytpunkterna och att det alltså rör sig om en obalanserad translokation. Med hjälp av array CGH blir de cytogenetiska fynden mer exakta och korrigerade.

Men även om gränserna mellan cytogenetik och molekylärgenetik blir alltmer suddiga är karyotypering fortfarande viktig eftersom vissa kromosomala förändringar inte kan upptäckas med array CGH: Polyploidier, verkligt balanserade translokationer och mosaiktillstånd med en liten andel avvikande celler.

På grund av den höga detektionsgraden över hela genomet och det faktum att det inte krävs någon tids- och arbetskrävande cellodling öppnar array-CGH nya möjligheter för prenatal diagnostik.

Men med alla de fördelar och möjligheter som denna banbrytande teknik erbjuder får man inte glömma bort att språnget från forskning till diagnostik bara är på väg att ske. Array CGH klargör alltså inte bara öppna frågor, utan tolkningen av resultaten kan också väcka nya frågor:

Med hjälp av array CGH-studier har man upptäckt att det mänskliga genomet innehåller en oväntat hög andel regioner vars kopianummer varierar hos fenotypiskt normala människor (se litteratur). Storleken på dessa CNV:er (”copy number variations”) varierar från några kilobaser till flera megabaser. Man uppskattar att varje individ har minst 3-11 sådana variationer. Databaser som förtecknar sådana polymorfismer (dvs. mutationer som inte uppenbart påverkar fenotypen) har just skapats och är därför fortfarande ofullständiga. Om avvikelser nu hittas i en patients DNA med hjälp av array CGH är det ofta spekulativt om dessa avvikelser är ansvariga för fenotypen överhuvudtaget. I de flesta fall är det också nödvändigt att undersöka föräldrarnas DNA.

Sannolikheten att en kromosomavvikelse är sjukdomsframkallande ökar

• med avvikelsens storlek
• om den förekommer ”de novo”, föräldrarna inte bär på denna avvikelse
• om den inte finns med i någon polymorfismdatabas
• om gener påverkas som kan förknippas med den observerade fenotypen
• om fall med samma eller liknande avvikelse är kända för att visa en liknande fenotyp.

Desto mer array CGH kommer att användas i klinisk diagnostik, desto mer sannolikt är det att arrayens utformning kommer att anpassas till kraven på detta område: Genom att undvika kända CNV-regioner och gynna kromosomala regioner och gener som är involverade i mental retardation och dysmorfiska syndrom kommer arrayer att bli alltmer intressanta för diagnostik före och efter födseln.

Vårt institut har lagt upp kursen för att dra nytta av array-tekniken nu och för att omedelbart kunna ta del av framtida utveckling. Vi har valt teknisk utrustning som också kan utvärdera matriser med högsta upplösning på ett tillförlitligt och reproducerbart sätt.

Kontakta oss om du vill använda våra tjänster och vår erfarenhet inom området array CGH. Vi informerar dig gärna om hur länge en sådan undersökning kommer att pågå, om kostnaderna och om de array-designs som för närvarande kan användas.

Referenser

Array CGH in mental retardation

Shaw-Smith C, Redon R, Rickman L, Rio M, Willatt L, Fiegler H, Firth H, Sanlaville D, Winter R, Colleaux L, Bobrow M, Carter NP. Mikroarraybaserad komparativ genomisk hybridisering (array-CGH) upptäcker submikroskopiska kromosomala deletioner och duplikationer hos patienter med inlärningssvårigheter/mental retardation och dysmorfiska drag. J Med Genet. 2004 Apr;41(4):241-8.

de Vries BB, Pfundt R, Leisink M, Koolen DA, Vissers LE, Janssen IM, Reijmersdal S, Nillesen WM, Huys EH, Leeuw N, Smeets D, Sistermans EA, Feuth T, van Ravenswaaij-Arts CM, van Kessel AG, Schoenmakers EF, Brunner HG, Veltman JA. Diagnostisk genomprofilering vid mental retardation. Am J Hum Genet. 2005 Oct;77(4):606-16.

Menten B, Maas N, Thienpont B, Buysse K, Vandesompele J, Melotte C, de Ravel T, Van Vooren S, Balikova I, Backx L, Janssens S, De Paepe A, De Moor B, Moreau Y, Marynen P, Fryns JP, Mortier G, Devriendt K, Speleman F, Vermeesch JR. Nya mönster av kryptiska kromosomala obalanser hos patienter med idiopatisk mental retardation och multipla medfödda anomalier: en ny serie på 140 patienter och en genomgång av litteraturen. J Med Genet. 2006.

Array-CGH in der Pränataldiagnostik

Rickman L, Fiegler H, Shaw-Smith C, Nash R, Cirigliano V, Voglino G, Ng BL, Scott C, Whittaker J, Adinolfi M, Carter NP, Bobrow M. Prenatala upptäckter av obalanserade kromosomala omläggningar med hjälp av array-CGH. J Med Genet. 2006 Apr;43(4):353-61.

Van den Veyver, IB; Beaudet AL. Jämförande genomisk hybridisering och prenatal diagnostik. Curr Opin Obstet Gynecol 2006 (18): 185-191.

Die Bedeutung der CNVs (copy number variations) für die Array-CGH

Feuk L, Carson AR, Scherer SW. Strukturell variation i det mänskliga genomet. Nat Rev Genet. 2006 Feb;7(2):85-97