Roth debuterade som skådespelare vid 21 års ålder, då han spelade en skinhead som är en vit supremacist och heter Trevor i tv-filmen Made in Britain. Han spelade en karaktär från East End i King of the Ghetto, ett kontroversiellt drama baserat på en roman av Farukh Dhondy som utspelade sig i Brick Lane och sändes av BBC 1986. Han spelade en blyg ung man i Mike Leigh-filmen Meantime från 1984.
1985 medverkade han i tv-filmen Murder with Mirrors. Han spelade en lärlingsmördare i Stephen Frears film The Hit och fick en Evening Standard Award för den mest lovande nykomlingen. År 1989 hade han en biroll som den bufflige lakejen Mitchell i Peter Greenaways The Cook, the Thief, His Wife & Her Lover. År 1990 spelade han huvudrollen som Vincent van Gogh i Robert Altmans Vincent & Theo och Guildenstern i Tom Stoppards Rosencrantz & Guildenstern Are Dead.
Roth och andra unga brittiska skådespelare i slutet av 1980-talet, såsom Gary Oldman, Colin Firth, Daniel Day-Lewis, Bruce Payne och Paul McGann, kallades för the Brit Pack. Roth fick rollen som ”Mr Orange” i Quentin Tarantinos film Reservoir Dogs från 1992. År 1994 gav Tarantino honom rollen som rånare i Pulp Fiction. De samarbetade också i filmen Four Rooms från 1995, där han spelade Ted. Hans roll som Archibald Cunningham i Rob Roy gav honom BAFTA Award för bästa skådespelare i en biroll samt en Oscar-nominering för bästa biroll och en Golden Globe-nominering.
År 1996 spelade han huvudrollen i Woody Allens musikaliska komedi Everyone Says I Love You. Han spelade också huvudrollen som ”Danny Boodman T.D. Lemon 1900” i The Legend of 1900, och samma år medverkade han i filmen Gridlock’d. Han gjorde sin regidebut 1999 med The War Zone, en filmatisering av Alexander Stuarts roman. År 2001 spelade han general Thade i Tim Burtons Planet of the Apes. Roth var det ursprungliga valet för rollen som Severus Snape i Harry Potter-filmserien, men han tackade nej till rollen för Planet of the Apes.
Han övervägdes för rollen som Hannibal Lecter i Hannibal-filmen från 2001 innan Anthony Hopkins återvände för att återta rollen. Han medverkade i Francis Ford Coppolas Youth Without Youth och Michael Hanekes Funny Games och spelade sedan huvudrollen som Emil Blonsky / Abomination, en ryskfödd officer i Storbritanniens Royal Marines Commandos, i The Incredible Hulk. Hulk-regissören Louis Leterrier var ett fan av Roths arbete, och regissören sa till tidningen Empire: ”Det är fantastiskt att se en vanlig cockneypojke bli en superhjälte!”.
Från 2009 till 2011 spelade han huvudrollen i Lie To Me i rollen som Cal Lightman, en expert på kroppsspråk som hjälper lokala och federala rättsvårdande myndigheter med att utreda brott. Han har varit ett fan av Monty Python sedan sin ungdom och medverkade 2009 i tv-dokumentären Monty Python: Almost the Truth (Lawyers Cut). År 2010 syntes Roth på omslaget till Manic Street Preachers 2010 års studioalbum Postcards from a Young Man.
Under 2012 tillkännagavs han som ordförande för juryn för Un Certain Regard-sektionen vid filmfestivalen i Cannes 2012. Han spelade huvudrollen som FIFA:s president Sepp Blatter i United Passions, en film om fotbollens styrande organ, som släpptes 2014 i samband med FIFA:s 110-årsjubileum och fotbolls-VM 2014. År 2015 spelade han huvudrollen i filmen Chronic som fick en begränsad premiär 2016. Han fick senare en nominering till Independent Spirit Award för bästa manliga huvudroll. Roth återförenades med Tarantino i The Hateful Eight (2015) och spelade Oswaldo Mobray/English Pete Hicox. År 2019 skulle Roth medverka i Tarantinos Once Upon a Time in Hollywood, men hans scener klipptes bort. Han ska återuppta sin roll som Emil Blonsky/Abomination i den kommande Disney+-serien She-Hulk, som utspelar sig i Marvel Cinematic Universe.