Roth debutó como actor a los 21 años, interpretando a un cabeza rapada supremacista blanco llamado Trevor en el telefilme Made in Britain. Interpretó a un personaje del East End en King of the Ghetto, un polémico drama basado en una novela de Farukh Dhondy ambientado en Brick Lane y emitido por la BBC en 1986. Interpretó a un joven tímido en la película de Mike Leigh de 1984 Meantime.
En 1985, apareció en el telefilme Asesinato con espejos. Interpretó a un aprendiz de sicario en la película de Stephen Frears The Hit, con la que obtuvo el premio Evening Standard al actor revelación más prometedor. En 1989 tuvo un papel secundario como el bufón lacayo Mitchell en El cocinero, el ladrón, su mujer & su amante, de Peter Greenaway. En 1990, protagonizó el papel de Vincent van Gogh en la película de Robert Altman Vincent & Theo y Guildenstern en Rosencrantz & Guildenstern Are Dead, de Tom Stoppard.
Roth y otros jóvenes actores británicos de finales de la década de 1980, como Gary Oldman, Colin Firth, Daniel Day-Lewis, Bruce Payne y Paul McGann, fueron apodados el Brit Pack. Roth fue elegido para el papel de «Mr. Orange» en la película de Quentin Tarantino Reservoir Dogs de 1992. En 1994, Tarantino le dio el papel de atracador en Pulp Fiction. También colaboró en la película de 1995 Four Rooms, donde interpretó a Ted. Su papel de Archibald Cunningham en Rob Roy le valió el premio BAFTA al mejor actor de reparto, así como una nominación al Oscar al mejor actor de reparto, y una nominación al Globo de Oro.
En 1996, protagonizó la comedia musical de Woody Allen Todos dicen que te quiero. También protagonizó el papel de «Danny Boodman T.D. Lemon 1900» en La leyenda de 1900, y ese mismo año coprotagonizó la película Gridlock’d. Debutó como director en 1999 con The War Zone, una versión cinematográfica de la novela de Alexander Stuart. En 2001, interpretó al general Thade en El planeta de los simios, de Tim Burton. Roth fue la elección original para el papel de Severus Snape en la serie de películas de Harry Potter, pero lo rechazó para El planeta de los simios.
Se le consideró para el papel de Hannibal Lecter en la película de 2001 Hannibal antes de que Anthony Hopkins volviera a reclamar el papel. Apareció en Juventud sin juventud, de Francis Ford Coppola, y en Funny Games, de Michael Haneke, y luego protagonizó el papel de Emil Blonsky / Abominación, un oficial de origen ruso de los Royal Marines Commandos del Reino Unido, en El increíble Hulk. El director de Hulk, Louis Leterrier, era un fan del trabajo de Roth, y el director dijo a la revista Empire: «¡Es genial ver a un chico normal de Cockney convertirse en un superhéroe!».
De 2009 a 2011, protagonizó Lie To Me como Cal Lightman, un experto en lenguaje corporal que ayuda a las organizaciones de la ley local y federal en las investigaciones de crímenes. Fan de los Monty Python desde su juventud, en 2009 apareció en el documental televisivo Monty Python: Casi la verdad (Lawyers Cut). En 2010, Roth apareció en la portada del álbum de estudio de Manic Street Preachers de 2010, Postcards from a Young Man.
En 2012, fue anunciado como presidente del jurado de la sección Un Certain Regard en el Festival de Cine de Cannes de 2012. Protagonizó el papel del presidente de la FIFA, Sepp Blatter, en Pasiones Unidas, una película sobre el organismo rector del fútbol, estrenada en 2014, coincidiendo con el 110º aniversario de la FIFA, y la Copa Mundial de la FIFA 2014. En 2015, protagonizó la película Chronic, que tuvo un estreno limitado en 2016. Posteriormente recibió una nominación al Premio Independent Spirit al Mejor Protagonista Masculino. Roth se reencontró con Tarantino en Los odiosos ocho (2015), interpretando a Oswaldo Mobray/el inglés Pete Hicox. En 2019, Roth iba a aparecer en Once Upon a Time in Hollywood, de Tarantino, pero sus escenas fueron cortadas. Está previsto que retome su papel de Emil Blonsky / Abominación en la próxima serie de Disney+ She-Hulk, ambientada en el Universo Cinematográfico de Marvel.