Vías de apoptosis extrínseca versus intrínseca en la quimioterapia contra el cáncer

Señalización a través de la vía intrínseca de la apoptosis

En la vía mitocondrial de la apoptosis, la activación de la caspasa está estrechamente vinculada a la permeabilización de la membrana mitocondrial externa por miembros proapoptóticos de la familia Bcl (Green y Kroemer, 2004). Numerosos estímulos citotóxicos y moléculas proapoptóticas transductoras de señales convergen en las mitocondrias para inducir la permeabilización de la membrana mitocondrial externa (Decaudin et al., 1998; Green y Kroemer, 2004). Esta permeabilización está regulada por proteínas de la familia Bcl-2, lípidos mitocondriales, proteínas que regulan el flujo de metabolitos bioenergéticos y componentes del poro de transición de permeabilidad (Green y Kroemer, 2004). Tras la ruptura de la membrana mitocondrial externa, se libera un conjunto de proteínas que normalmente se encuentran en el espacio entre las membranas mitocondriales interna y externa, incluyendo el citocromo c, Smac/DIABLO, Omi/HtrA2, AIF y la endonucleasa G (Saelens et al., 2004). Una vez en el citosol, estas proteínas apoptógenas desencadenan la ejecución de la muerte celular promoviendo la activación de las caspasas o actuando como efectores de muerte independientes de las caspasas (Saelens et al., 2004).

Mediadores mitocondriales de la apoptosis dependiente de caspasas

Citocromo c

La liberación de citocromo c de las mitocondrias desencadena directamente la activación de la caspasa-3 mediante la formación del complejo apoptosómico que contiene citocromo c/Apaf-1/caspasa-9 (Cain et al., 2000). Una vez en el citosol, el citocromo c se une a la región C-terminal de Apaf-1, una proteína citosólica con un dominio N-terminal de reclutamiento de caspasas (CARD), un dominio de unión a nucleótidos con homología al CED-4 de Caenorhabditis elegans y un dominio C-terminal que contiene 12-13 repeticiones WD-40 (Zou et al., 1997). La unión del citocromo c a Apaf-1 facilita la asociación del dATP con Apaf-1 y expone su CARD N-terminal, que ahora puede oligomerizarse y convertirse en una plataforma en la que la caspasa-9 iniciadora es reclutada y activada a través de una interacción CARD-CARD (Adrain et al., 1999). Consecutivamente, la caspasa-3 ejecutora es reclutada al apoptosoma, donde es activada por la caspasa-9 residente (Bratton et al., 2001). A continuación, la caspasa-3 escinde sustratos clave en la célula para producir muchos de los acontecimientos celulares y bioquímicos de la apoptosis.

En ciertos casos, la actividad de la caspasa instigada por el citocromo c citosólico contribuye a la caída de la metaloproteinasa de la matriz (MMP), como se demostró mediante el uso de inhibidores sintéticos de la caspasa y células Apaf1 -/- (Waterhouse et al., 2001). Además, la actividad de las caspasas daña aún más la función de las mitocondrias permeabilizadas al afectar a la actividad de los complejos I y II, lo que conduce inevitablemente a la pérdida de MMP y a la generación de especies reactivas de oxígeno (Ricci et al., 2004). Por lo tanto, los eventos secundarios resultantes de los cambios citosólicos, causados por la liberación de citocromo c y otras proteínas mitocondriales IMS, pueden retroalimentar a las mitocondrias permeabilizadas y afectar a su función. Es importante destacar que este bucle de amplificación mitocondrial de la actividad de las caspasas puede determinar de forma crítica la respuesta de las células cancerosas a los tratamientos citotóxicos.

Además, hay pruebas recientes de la existencia de un mecanismo(s) de activación de las caspasas independiente del citocromo c y del apoptosoma, pero dependiente de Apaf-1. Un knock-in dirigido de una variante del citocromo c que carece de propiedades apoptógenas, pero tiene actividad de transferencia de electrones y antioxidante (K72A), permitió evaluar la contribución del citocromo c a la apoptosis sin afectar a su función en la fosforilación oxidativa (Hao et al., 2005). Curiosamente, los timocitos de los ratones KA/KA fueron notablemente más sensibles a los estímulos de muerte, incluyendo el etopósido y la γ-irradiación, que los timocitos Apaf-1(-/-) (Hao et al., 2005). Tras el tratamiento con γ-irradiación, las procaspasas se activaron eficazmente en los timocitos apoptóticos KA/KA, pero no se observó la oligomerización de Apaf-1 (Hao et al., 2005), lo que apunta a un requisito diferencial para el citocromo c y el Apaf-1 en la apoptosis.

Smac/DIABLO

Otras proteínas liberadas de las mitocondrias, como Smac/DIABLO y Omi/HtrA2, facilitan la activación de las caspasas mediante la neutralización de los inhibidores endógenos de las caspasas, las proteínas inhibidoras de la apoptosis (IAP). Smac y su homólogo murino DIABLO son proteínas mitocondriales codificadas en el núcleo, que contienen una señal de localización mitocondrial, que se elimina proteolíticamente durante la importación mitocondrial para producir la proteína madura de 23 kDa (Du et al., 2000; Verhagen et al., 2000). Este paso de maduración expone el motivo de unión a IAP (IBM) en el N-terminal de Smac/DIABLO (Du et al., 2000) (Tabla 1). Se ha demostrado que el segundo activador de caspasas derivado de las mitocondrias/DIABLO se une a XIAP, cIAP1, cIAP2, survivin y Apollon de forma dependiente de BIR (Vaux y Silke, 2003) (Figura 2), y actúa como homodímero con el IBM presente en una configuración bivalente (Chai et al., 2000). Un dímero de Smac/DIABLO se une a una molécula de XIAP por ambos motivos de unión a IAP, uno interactuando con BIR2 y el otro con BIR3 (Huang et al., 2003). Curiosamente, el mismo surco de BIR3 se une a la IBM expuesta en el N-terminal (Ala-Thr-Pro-Phe) de la subunidad pequeña de la caspasa-9 tras su procesamiento autocatalítico después de Asp315, permitiendo que Smac/DIABLO desplace a la caspasa-9 de XIAP (Srinivasula et al., 2001) (Tabla 1).

La función mitocondrial fisiológica de Smac/DIABLO es desconocida, y los ratones DIABLO -/- parecen normales (Okada et al., 2002). Aunque la escisión in vitro de la procaspasa-3 tras la adición de citocromo c se inhibió en lisados de células Smac -/-, los ratones y las células Smac -/- respondieron normalmente a estímulos apoptóticos como la irradiación UV, la estaurosporina, el etopósido y el TNF/ciclohexamida (Okada et al., 2002). Estas observaciones sugieren la existencia de factores redundantes que compensan la pérdida de Smac/DIABLO, posiblemente HtrA2/OMI.

Omi/HtrA2 es una proteína de 49 kDa codificada en el núcleo con una señal de localización mitocondrial N-terminal que media su translocación al espacio intermembrana mitocondrial (Suzuki et al., 2001; Martins et al., 2002; van Loo et al., 2002). Omi/HtrA2 se procesa en el espacio intermembranal en la forma madura de 37 kDa, liberando un IBM en su N-terminal (Suzuki et al., 2001; Martins et al., 2002; van Loo et al., 2002) (Tabla 1). Aunque la Omi/HtrA2 recombinante puede catalizar su propia maduración in vitro, la proteasa responsable de su maduración en las células sigue siendo desconocida (Martins et al., 2002). Omi/HtrA2 desempeña un papel esencial en la regulación de la homeostasis mitocondrial que requiere su actividad proteolítica, aunque todavía no se han definido las dianas moleculares y los socios de interacción de Omi/HtrA2 en la mitocondria (Saelens et al., 2004). Una vez que Omi/HtrA2 se libera de las mitocondrias al citosol, promueve la muerte celular de forma dependiente de las caspasas al antagonizar las IAPs, y de forma independiente de las caspasas como proteasa (Saelens et al., 2004). De forma similar a Smac/DIABLO, Omi/HtrA2 bloquea los IAPs a través de su motivo de unión a IAPs N-terminal, presentado en una configuración trimérica (Li et al., 2002)

Aunque la liberación del citocromo c en el citosol desencadena directamente la activación de la caspasa-3 a través de la formación del complejo apoptosómico que contiene citocromo c/Apaf-1/caspasa-9, Smac/DIABLO y Omi/HtrA2 promueven indirectamente la activación de la caspasa a través del antagonismo de los efectos inhibidores de las IAPs (Saelens et al., 2004). Así, existe un equilibrio dinámico entre las moléculas efectoras pro y antiapoptóticas, que permite a la célula hacer frente a un daño mitocondrial limitado, en cuyo caso las PAI pueden bloquear adecuadamente la activación de las caspasas iniciada por una pequeña cantidad de citocromo c liberado. Sin embargo, en circunstancias en las que el daño mitocondrial avanza o afecta simultáneamente a múltiples mitocondrias, el obstáculo antiapoptótico impuesto por las PAI puede ser superado por la mayor concentración citosólica de sus antagonistas Smac/DIABLO y HtrA2/OMI, que neutralizan a las PAI mediante su unión directa.

Existen cada vez más pruebas de que las células cancerosas tienen un impulso intrínseco hacia la apoptosis que es frenado por las PAI. Con este fin, se han detectado altos niveles basales de actividades de caspasa-3 y caspasa-8 y fragmentos activos de caspasa-3 en ausencia de apoptosis en varias líneas celulares tumorales y tejidos cancerosos, pero no en células normales (Yang et al., 2003a). Las células tumorales, pero no las normales, también expresaron niveles elevados de PAI, lo que sugiere que la expresión regulada de PAI contrarrestó la elevada actividad basal de las caspasas selectivamente en las células tumorales (Yang et al., 2003a). Por lo tanto, las estrategias dirigidas a las IAP se consideran un enfoque prometedor para mejorar la eficacia de las terapias citotóxicas de forma selectiva en las células cancerosas. Con este fin, la expresión reforzada por transfección de Smac/DIABLO redujo el umbral de muerte inducida por TRAIL en diferentes tumores (Ng y Bonavida, 2002; Okano et al., 2003) y también sensibilizó a las células cancerosas para la quimioterapia (McNeish et al., 2003; Zhao et al., 2006). Sin embargo, la translocación de Smac/DIABLO endógena al citosol durante la apoptosis inducida por fármacos anticancerosos no parece desempeñar un papel importante en determinadas condiciones, por ejemplo, en células de carcinoma de pulmón humano tras el tratamiento con etopósido (Bartling et al., 2004). La regulación a la baja de Smac/DIABLO mediante un pequeño ARN de interferencia (siRNA) no influyó en la muerte por etopósido en estas células, aunque un péptido de unión a IAP, Smac-N7, aumentó la apoptosis inducida por etopósido (Bartling et al., 2004). Estos datos sugieren que la deficiencia de Smac/DIABLO puede ser compensada por la acción de determinantes redundantes en ciertas células cancerosas.

Mediadores mitocondriales de la apoptosis independiente de las caspasas

Al liberarse del espacio intermembrana mitocondrial, HtrA2/OMI contribuye a la muerte celular también de forma independiente de las caspasas como proteasa además de promover la apoptosis de forma dependiente de las caspasas al antagonizar las IAPs (Suzuki et al., 2001; Martins et al., 2002; van Loo et al., 2002). Los datos in vitro demostraron la degradación de XIAP, cIAP1, cIAP2 y Apollon por la actividad proteasa de HtrA2/OMI (Suzuki et al., 2004). Además, Trencia et al. (2004) demostraron la interacción del antiapoptótico PED/PEA-15 con la HtrA2/OMI citosólica y su degradación por ella. La disminución de los niveles de HtrA2/OMI en las células mediante antisentido o ARN de interferencia disminuye la sensibilidad de diferentes líneas celulares de cáncer a la muerte celular inducida por estaurosporina, Fas, UV o cisplatino (Martins et al., 2002).

Además, la AIF y la endonucleasa G se liberan de las mitocondrias tras la permeabilización de la membrana mitocondrial externa y se trasladan al núcleo para contribuir a la condensación de la cromatina nuclear y a la fragmentación del ADN a gran escala (Cande et al., 2004; Saelens et al., 2004). Se ha discutido de forma controvertida si estas dos proteínas se liberan antes, junto o después del citocromo c (Arnoult et al., 2002). Además, todavía no está claro cómo contribuye AIF a la fragmentación del ADN nuclear, ya que carece de actividad DNasa intrínseca. En las células de mamíferos, la ciclofilina A, una peptidil-prolyl cis-trans isomerasa, coopera con AIF para inducir la ruptura del ADN (Cande et al., 2004).

Disrupción de la vía intrínseca en el cáncer

Las mutaciones en los genes implicados en la regulación de la vía mitocondrial son muy comunes en las células cancerosas. Dado que la mayoría de las terapias contra el cáncer inducen la apoptosis en las células cancerosas mediante la activación de la vía intrínseca, estas mutaciones suelen estar asociadas a la resistencia al tratamiento. Por ejemplo, la sobreexpresión de Bcl-2, como resultado de la translocación cromosómica del oncogén bcl-2 en el locus del gen de la cadena pesada de la inmunoglobulina, se asocia con aproximadamente el 85% de los linfomas foliculares humanos (Tsujimoto et al., 1984). Los experimentos con ratones transgénicos han demostrado que la sobreexpresión de Bcl-2 puede promover la transformación neoplásica de los linfocitos B y T y de las células mieloides (McDonnell y Korsmeyer, 1991; Traver et al., 1998).

Dado el hecho de que la sobreexpresión de los miembros antiapoptóticos de la familia Bcl-2 promueve la oncogénesis, se deduce que los miembros proapoptóticos de dominio múltiple BH de esta familia actúan como supresores tumorales. Sin embargo, dado que Bax y Bak tienen funciones que se solapan en gran medida en la apoptosis, ha sido difícil determinar si esta hipótesis es cierta y, de hecho, los ratones bax-/- no están notablemente predispuestos a la neoplasia (Knudson et al., 2001). Sin embargo, se han encontrado mutaciones somáticas que inactivan el gen bax en ciertos tumores sólidos y neoplasias hematológicas. En este sentido, se han descrito mutaciones de sustitución de un solo nucleótido o de cambio de marco, que inactivan el gen Bax en el cáncer de colon deficiente en la reparación de emparejamientos (MMR) o en las neoplasias hematopoyéticas (Rampino et al., 1997; Kitada et al., 2002).

Además, cada vez hay más pruebas de que las proteínas que sólo contienen BH3 pueden contribuir a la supresión de la transformación maligna, lo que indica que pueden funcionar como supresores tumorales de buena fe. Por ejemplo, se ha demostrado que la pérdida de un único alelo de Bim acelera la linfomagénesis de células B inducida por la expresión de un transgén c-myc (Egle et al., 2004), en línea con el papel clave de Bim como regulador de la homeostasis linfoide (Strasser, 2005). Curiosamente, recientemente se han identificado deleciones homocigóticas en la región cromosómica que alberga el gen bim en pacientes con linfoma de células del manto (Tagawa et al., 2005). Los ratones que carecen de bim desarrollan espontáneamente un trastorno mieloproliferativo que puede progresar a una neoplasia parecida a la leucemia mielomonocítica crónica (LMMC) (Zinkel et al., 2003). Además, se ha informado de que la supresión de Puma mediada por ARNi acelera la linfomagénesis inducida por Myc (Hemann et al., 2004).

Además de las alteraciones genéticas, la expresión aberrante de las proteínas de la familia Bcl-2 se regula principalmente a nivel transcripcional o postranscripcional. Por ejemplo, la expresión de varias proteínas antiapoptóticas de la familia Bcl-2, por ejemplo, Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1 o Bfl-1, está regulada transcripcionalmente por el NF-κB (Cory y Adams, 2002).

Además de las proteínas de la familia Bcl-2, se ha encontrado una actividad disminuida o ausente de Apaf-1 en el cáncer de ovario, el melanoma y la leucemia. Además, las mutaciones en el gen supresor de tumores p53, el defecto genético más común en los cánceres humanos, inciden en la vía intrínseca. Por ejemplo, la activación de p53 regula al alza una serie de genes que poseen elementos de respuesta a p53 presentes en sus promotores, como las proteínas proapoptóticas BH3-only Puma, Noxa y Bid (Oda et al., 2000; Yu et al., 2001; Sax et al., 2002). Como resultado, las células en las que se estabiliza p53 están sensibilizadas para la activación de la vía de muerte celular mitocondrial. Además, p53 puede afectar directamente a la integridad mitocondrial sin necesidad de activar el gen. De hecho, se ha informado de que p53 puede unirse a Bcl-2 y Bcl-XL en la mitocondria, promoviendo así la desestabilización mitocondrial (Mihara et al., 2003).

Señalización a través de la vía intrínseca en la terapia del cáncer

La mayoría de los agentes quimioterapéuticos convencionales, por ejemplo, el etopósido, la doxorrubicina, el cisplatino o el paclitaxel, provocan la permeabilización mitocondrial de forma indirecta al desencadenar perturbaciones del metabolismo intermedio o al aumentar la concentración de segundos mensajeros proapoptóticos, por ejemplo, induciendo la expresión de p53, induciendo la vía de la ceramida/GD3, induciendo el sistema de ligandos CD95/CD95L, afectando a las proteínas similares a Bcl-2 y/o comprometiendo el equilibrio redox o energético.

Hay cada vez más pruebas de la existencia de una comunicación cruzada núcleo-mitocondrial tras un daño en el ADN. Por ejemplo, las señales apoptóticas derivadas del daño en el ADN pueden transmitirse a través del supresor de tumores p53 a las mitocondrias, que a su vez liberan factores apoptógenos en el citoplasma que activan los programas de destrucción posteriores (Moll et al., 2005). p53 puede comprometer indirectamente la vía mitocondrial activando transcripcionalmente la expresión de las proteínas proapoptóticas Bcl-2, por ejemplo, Bid, Puma o Noxa (Oda et al., 2000; Yu et al., 2001; Sax et al., 2002). Además, p53 puede desencadenar directamente la permeabilización de la membrana mitocondrial externa de forma independiente de la transcripción a través de la activación directa de las proteínas proapoptóticas Bcl-2 Bax o Bak o a través de la unión e inactivación de las proteínas antiapoptóticas Bcl-2 como Bcl-2 o Bcl-XL (Mihara et al., 2003; Chipuk et al., 2004; Moll et al., 2005). Es importante destacar que recientemente se ha demostrado que la p53 dirigida a las mitocondrias posee actividades supresoras de tumores también in vivo (Talos et al., 2005).

Además, la caspasa-2 posee la capacidad de activar la vía apoptótica mitocondrial en respuesta al daño del ADN permeabilizando la membrana mitocondrial externa y/o rompiendo la asociación del citocromo c con la membrana mitocondrial interna. Por lo tanto, las células transfectadas de forma estable con procaspasa-2 antisentido, o que expresan transitoriamente ARNsi, fueron refractarias a la liberación de citocromo c y a varios eventos posteriores, como la activación de caspasas y la fragmentación del ADN, inducidos por el daño del ADN (Lassus et al., 2002; Robertson et al., 2002). La caspasa-2 puede actuar indirectamente en la mitocondria, por ejemplo, escindiendo la proteína proapoptótica Bid, seguida de su translocación a la mitocondria para inducir la liberación de citocromo c (Guo et al., 2002). Además, la caspasa-2 puede permeabilizar directamente la membrana externa de la mitocondria y estimular la liberación de citocromo c y Smac/DIABLO, posiblemente como resultado de la interacción directa de la caspasa-2 procesada con proteínas putativas y/o fosfolípidos localizados en la membrana externa de la mitocondria, o en sitios de contacto entre las membranas externa e interna (Robertson et al., 2004). La permeabilización de la membrana mitocondrial externa requiere el procesamiento del zimógeno de la caspasa-2, pero no la actividad proteolítica asociada, y ocurre independientemente de varias proteínas de la familia Bcl-2, incluyendo Bax, Bak y Bcl-2 (Robertson et al., 2004). Además, se ha demostrado que la caspasa-2 tiene la sorprendente capacidad de interrumpir la asociación entre el citocromo c y los fosfolípidos aniónicos, especialmente la cardiolipina, lo que hace que el citocromo c adicional esté disponible para su liberación en el citosol (Enoksson et al., 2004). Recientemente se ha informado de que la caspasa-2 se activa en el llamado PIDDosoma, un complejo de la proteína inducible por p53 que contiene el dominio de la muerte PIDD, la caspasa-2 y la proteína adaptadora RAIDD (Tinel y Tschopp, 2004), lo que apunta a la existencia de una vía apoptótica nucleo-mitocondrial.

Además, se ha informado de que la histona H1.2 desempeña un papel importante en la transmisión de señales apoptóticas desde el núcleo a la mitocondria tras las roturas de doble cadena de ADN (Konishi et al., 2003). La histona nuclear H1.2 se libera al citoplasma a través de un mecanismo dependiente de p53 después de las roturas de doble cadena de ADN e induce la liberación de citocromo c de las mitocondrias aisladas de forma dependiente de Bak (Konishi et al., 2003). La reducción de la expresión de H1.2 mejoró la resistencia celular a la apoptosis inducida por la irradiación de rayos X o el etopósido (Konishi et al., 2003).

Además, el receptor nuclear huérfano Nur77 (también conocido como TR3) se ha acoplado recientemente a la maquinaria apoptótica Bcl-2 en la mitocondria (Lin et al., 2004). La unión de Nur77 a la región del bucle N-terminal de Bcl-2, situada entre sus dominios BH4 y BH3, induce un cambio conformacional de Bcl-2 que expone su dominio BH3, lo que resulta en la conversión de Bcl-2 de protector a asesino (Lin et al., 2004). Curiosamente, los niveles elevados de un miembro de la familia Nur77 se han asociado con respuestas favorables a los agentes quimioterapéuticos en los pacientes (Shipp et al., 2002).

Además, ante el estrés celular, incluidos los fármacos quimioterapéuticos, los miembros específicos de la familia Bcl-2 proapoptótica se activan, se despresionan o se inducen, y por tanto actúan como sensores. La actividad de las proteínas sólo BH3 se mantiene controlada por varios mecanismos, manteniendo estas proteínas alejadas de las homólogas Bcl-2 multidominio en circunstancias normales, pero permitiendo su rápida activación en condiciones de estrés (Bouillet y Strasser, 2002). Como se ha mencionado anteriormente, las proteínas de la familia Bcl-2, como Bid, Puma o Noxa, están bajo el control transcripcional del supresor tumoral p53 y, por tanto, se regulan al alza en respuesta a los agentes que dañan el ADN (Oda et al., 2000; Yu et al., 2001; Sax et al., 2002). La proteína BH3 Bim, que se asocia al citoesqueleto uniéndose a los microtúbulos, se libera y activa la vía intrínseca tras el tratamiento con taxol, que actúa sobre el ensamblaje de los microtúbulos (Sunters et al., 2003). Recientemente, se ha demostrado que el paclitaxel induce la acumulación de Bim y la apoptosis dependiente de Bim en tumores epiteliales in vitro y también in vivo (Tan et al., 2005). Las proteínas BH3 activas se unen y contrarrestan a los antiapoptóticos y, en algunos casos, activan a los miembros de la familia Bcl-2 multidominio proapoptóticos, lo que conduce a la pérdida de permeabilidad de la membrana mitocondrial (Bouillet y Strasser, 2002). El modo en que las proteínas Bcl-2 inducen la alteración de la membrana externa mitocondrial sigue siendo objeto de debate y puede implicar la capacidad de formación de poros y de autooligomerización de algunas proteínas de la familia Bcl-2, la modulación del poro de transición de permeabilidad mitocondrial por parte de las proteínas de la familia Bcl-2 y/o los cambios lipídicos y las interacciones de las proteínas lipídicas dentro de las membranas mitocondriales. Además, los agentes quimioterapéuticos como el paclitaxel provocan la hiperfosforilación e inactivación de Bcl-2 y, simultáneamente, favorecen la apertura del poro de transición de permeabilidad (PT) (Ruvolo et al., 2001).

Los fármacos quimioterapéuticos también pueden inducir o facilitar la permeabilización de la membrana mitocondrial externa a través de cambios en los potenciales redox celulares debido a una mayor generación de especies reactivas de oxígeno (o una disminución de su desintoxicación), el agotamiento del glutatión reducido o el agotamiento del NADPH, ya que el megacanal mitocondrial posee varios sitios sensibles al redox (Debatin et al., 2002). Además, los cambios en el metabolismo energético, por ejemplo el agotamiento del ADP y el ATP, podrían facilitar la apertura del complejo de poros de transición de permeabilidad (PTPC), ya que el ADP y el ATP son los ligandos fisiológicos del translocador de nucleótidos de adenina, que funcionan como inhibidores endógenos del PTPC (Costantini et al., 2000). Asimismo, el desacoplamiento o la inhibición de la cadena respiratoria o la alcalinización de la matriz pueden favorecer la permeabilización de la membrana mitocondrial. Además, los mensajeros lipídicos como la ceramida, que se genera en las células expuestas a varios estímulos que inducen la apoptosis, incluidos los fármacos citotóxicos, pueden contribuir a la permeabilización de la membrana mitocondrial (Susin et al., 1997). A altas concentraciones, algunos fármacos quimioterapéuticos, por ejemplo, el etopósido o el paclitaxel, también pueden inducir la permeabilización de la membrana externa mitocondrial en mitocondrias aisladas (Robertson et al., 2000; Kidd et al., 2002).

Además, se ha demostrado que un número cada vez mayor de fármacos anticancerígenos experimentales, como el arsenito, la lonidamida, el retinoide sintético CD437 o el producto natural ácido betulínico, actúan directamente sobre las mitocondrias (Debatin et al., 2002). Por ejemplo, se ha informado de que el ácido betulínico desencadena la apoptosis induciendo directamente la pérdida del potencial de la membrana mitocondrial en mitocondrias aisladas de una forma que no se ve afectada por el inhibidor de caspasas Z-VAD-fmk y que, sin embargo, es inhibida por el BA, un inhibidor de la PTPC, o por Bcl-2 y Bcl-XL (Fulda et al., 1998b).

Estrategias dirigidas a la vía intrínseca

Proteínas de la familia Bcl-2

Dado que las proteínas antiapoptóticas Bcl-2, que bloquean de forma potente la vía intrínseca de la apoptosis, se encuentran en niveles elevados en los cánceres humanos tanto de origen hematológico como no hematológico (Cotter, 2004), representan objetivos prometedores para las intervenciones terapéuticas. En consecuencia, se han desarrollado varias estrategias para dirigirse a las proteínas Bcl-2, por ejemplo, técnicas antisentido, péptidos de dominio BH3 o fármacos sintéticos de moléculas pequeñas que interfieren en la función de la proteína Bcl-2. Para regular a la baja la expresión de Bcl-2, Genta Incorporated (Berkeley Heights, NJ, EE.UU.) desarrolló oligonucleótidos en antisentido de Bcl-2 (genasense). El genasense es un oligonucleótido de fosforotioato sintético de 18 bases que se dirige selectivamente a los seis primeros codones (es decir, 18 bases) del marco de lectura abierto del ARNm que codifica la proteína Bcl-2 (Cotter, 2004). El tratamiento con genasense mejoró notablemente la actividad antitumoral de muchos fármacos quimioterapéuticos, por ejemplo, taxanos, antraciclinas, alquiladores o agentes que contienen platino (Cotter, 2004). En un modelo preclínico de melanoma, el pretratamiento con genasense aumentó la quimiosensibilidad del melanoma humano (Jansen et al., 1998). También en un ensayo clínico, se informó de que el genasense actuaba como quimiosensibilizador de la dacarbazina en pacientes con melanoma maligno (Jansen et al., 2000). Para optimizar la terapia basada en el antisentido, se diseñaron posteriormente oligonucleótidos antisentido biespecíficos dirigidos contra una secuencia altamente homóloga en Bcl-2 y Bcl-xL, pero ausente en el ARNm de Bcl-xS (Zangemeister-Wittke et al., 2000). La regulación a la baja simultánea de Bcl-2 y Bcl-xL indujo la apoptosis y mejoró la quimiosensibilidad en varias células cancerosas (Gautschi et al., 2001; Tortora et al., 2003; Milella et al., 2004; Yamanaka et al., 2005).

Además, se desarrollaron péptidos con dominio BH3 o inhibidores sintéticos de moléculas pequeñas para dirigirse a las proteínas antiapoptóticas similares a Bcl-2. El dominio BH3 comprende una hélice α anfipática de nueve aminoácidos que se une a un bolsillo hidrofóbico de las proteínas tipo Bcl-2 (Cory y Adams, 2002). Del mismo modo, los péptidos del dominio BH3 tienen como objetivo interrumpir este complejo, sensibilizando así a las células cancerosas a la apoptosis (Letai et al., 2002). Además, la sustitución del dominio BH3 de Bid con aminoácidos no naturales en la superficie opuesta a la región de interacción mediante el grapado de hidrocarburos dio lugar a péptidos BH3 estabilizados denominados SAHBs (α-hélice estabilizada de los dominios Bcl-2), con propiedades farmacológicas mejoradas (Walensky et al., 2004). Estos péptidos BH3 estabilizados desencadenaron la apoptosis en una variedad de líneas celulares leucémicas y también inhibieron el crecimiento de xenoinjertos de leucemia en ratones sin efectos secundarios adversos (Walensky et al., 2004).

También se han identificado varios compuestos de moléculas pequeñas que interfieren con la función Bcl-2/Bcl-xL. El cribado de una biblioteca química en busca de compuestos capaces de unirse al bolsillo BH3 de las proteínas Bcl-2 dio como resultado la identificación de HA14-1, un compuesto que compite con Bak por la unión a Bcl-2 (Wang et al., 2000). Mediante el cribado de una biblioteca de 16.320 compuestos preseleccionados para la capacidad de desplazar un péptido Bak BH3 fluorescente de Bcl-xL en un ensayo de polarización fluorescente, Degterev et al. (2003) identificaron dos clases de agentes denominados inhibidores de BH3 (BH3Is), que también interrumpen el complejo de Bcl-xL con Bax y Bad en células intactas.

Usando el cribado basado en la resonancia magnética nuclear (RMN), la síntesis paralela y el diseño basado en la estructura, se descubrió recientemente un inhibidor de moléculas pequeñas de las proteínas antiapoptóticas Bcl-2, Bcl-X(L) y Bcl-w, ABT-737. ABT-737 fue eficaz como agente único contra ciertos linfomas y tumores sólidos y mostró una citotoxicidad sinérgica con los quimioterapéuticos y la radiación (Oltersdorf et al., 2005).

Agonistas de Smac/DIABLO

Para el diseño de pequeñas moléculas potencialmente terapéuticas dirigidas a XIAP, el surco de unión del dominio BIR3 de XIAP, al que se une Smac/DIABLO tras su liberación de las mitocondrias, ha atraído la mayor atención. El análisis estructural ha proporcionado un fundamento claro para la síntesis de pequeños compuestos que pueden imitar la actividad de desplazamiento de la caspasa-9 de Smac/DIABLO del BIR3 de XIAP (Chai et al., 2000; Wu et al., 2000). Para mejorar la entrega intracelular, los péptidos Smac se unieron a un portador, por ejemplo, el motivo de transducción de la proteína Tat del VIH (Fulda et al., 2002), la secuencia de penetratina de la antennapaedia de Drosophila (Arnt et al., 2002) o un tramo de poliarginina (Yang et al., 2003b). Se ha informado de que un heptapéptido que representa el N-terminal de Smac/DIABLO maduro, que es esencial para la unión a XIAP, promueve la activación de caspasas y sensibiliza a varias líneas celulares tumorales y también a células tumorales primarias derivadas de pacientes para la apoptosis inducida por la ligadura de receptores de muerte o por fármacos citotóxicos (Fulda et al., 2002). Es importante destacar que los péptidos Smac incluso mejoraron la actividad antitumoral de TRAIL in vivo en un modelo de xenoinjerto de glioma maligno intracraneal (Fulda et al., 2002b). Del mismo modo, un péptido de 8 polímeros (AVPIAQKS) fusionado con el dominio de transducción de proteínas de la penetratina de Drosophila antennapaedia fue capaz de entrar en las células de cáncer de mama, unirse a XIAP y cIAP1, y potenciar la actividad de las caspasas inducida por una serie de fármacos anticancerígenos, como el paclitaxel, el etopósido, la 7-etil-10-hidroxicamptotecina (SN-38) y la doxorrubicina (Arnt et al., 2002). Además, sobre la base de la estructura tridimensional de Smac/DIABLO en complejo con XIAP BIR3, se diseñaron peptidomiméticos de Smac, que cooperaban con TRAIL, TNFα, cisplatino o etopósido para desencadenar la apoptosis en las células tumorales (Li et al., 2004; Sun et al., 2004a, 2004b, 2005).

Por consiguiente, se desarrollaron pequeños antagonistas moleculares no peptídicos de XIAP, derivados del cribado de una biblioteca de fagos o de una biblioteca de polifenilureas, para dirigirse a los IAP (Schimmer et al., 2004; Wang et al., 2004). Además, el producto natural embelin, procedente de la hierba japonesa Ardisia, se descubrió recientemente como un inhibidor de XIAP permeable a las células, no peptídico y de pequeño peso molecular, mediante el cribado computacional basado en la estructura de una base de datos de estructuras tridimensionales de medicina herbal tradicional (Nikolovska-Coleska et al., 2004). Se demostró que la embelina superaba eficazmente el efecto protector de XIAP en células de cáncer de próstata con altos niveles endógenos de XIAP o en células Jurkat transfectadas con XIAP mediante la unión al dominio BIR3 de XIAP (Nikolovska-Coleska et al., 2004). Así pues, los agonistas de Smac o los antagonistas de XIAP de bajo peso molecular pueden ser candidatos prometedores para la terapia del cáncer al potenciar la eficacia de las terapias citotóxicas de forma selectiva en las células cancerosas.