- Quem escolher para Estudos de Microbioma
- O que é 16S rRNA Gene Sequencing?
- What is Shotgun Metagenomic Sequencing?
- 16S/ITS seqüenciamento vs. seqüenciamento metagenômico de shotgun
- Resolução taxonômica
- Functional profiling
- Cobertura microbial e tipo de amostra recomendado
- False positives
- Interferência do ADN hospedeiro
- Entrada de ADN
- Aqui para ajudar
- Descubra qual método de sequenciamento é melhor para você. Fale com os especialistas que fornecem os Serviços de Sequenciação ZymoBIOMICS.
Quem escolher para Estudos de Microbioma
16S seqüenciamento ou seqüenciamento de shotgun? Quase todos os pesquisadores de microbiomas se perguntam isso ao planejar um novo estudo, pois a grande maioria das publicações sobre microbiomas utiliza o seqüenciamento do gene 16S rRNA ou o seqüenciamento metagenômico por caçadeira para gerar dados brutos para posterior perfilamento microbiano ou análises metagenômicas. Cada método tem seus prós e contras, portanto, qual método você deve escolher?
O que é 16S rRNA Gene Sequencing?
16S rRNA gene sequencing, ou simplesmente 16S sequencing, utiliza PCR para alvejar e amplificar porções das regiões hipervariáveis (V1-V9) do gene 16S rRNA da bactéria1. Amplicões de amostras separadas são então dados códigos de barras moleculares, agrupados e sequenciados. Após o sequenciamento, os dados brutos são analisados com um pipeline bioinformático que inclui corte, correção de erros e comparação com uma base de dados de referência 16S. Após as leituras serem atribuídas a uma classificação filogenética, um perfil de taxonomia pode ser gerado. Da mesma forma, o sequenciamento ITS segue a mesma estratégia, mas visando a região ITS (Internal transcribed spacer) encontrada em genomas fúngicos.
What is Shotgun Metagenomic Sequencing?
Unlike 16S sequencing, que só visa 16S rRNA genes, sequências de sequenciamento metagenómico de shotgun, todos dados de ADN genómico de uma amostra. O fluxo de trabalho de preparação da biblioteca é semelhante ao sequenciamento regular de todo o genoma, incluindo fragmentação aleatória e ligação do adaptador. Um fluxo de trabalho típico para a análise taxonômica de dados metagenômicos de caçadeira inclui corte de qualidade e comparação com uma base de dados de referência compreendendo genomas inteiros (por exemplo, Kraken2 e Centrifuge3) ou genes marcadores selecionados (MetaPhlAn4 e mOTU5) para gerar um perfil taxonômico. Como o seqüenciamento metagenômico com shotgun cobre toda a informação genética em uma amostra, os dados podem ser usados para análises adicionais, por exemplo, montagem metagenômica e encadeamento, perfil da função metagenômica e perfil do gene de resistência a antibióticos.
16S/ITS seqüenciamento vs. seqüenciamento metagenômico de shotgun
Se o seu estudo requer análises genômicas além do perfil de taxonomia, como a análise da via metabólica, você deve considerar o seqüenciamento metagenômico de shotgun devido à sua maior cobertura genômica e saída de dados. Se o perfil de composição é o objetivo principal do estudo, ambas as técnicas têm prós e contras a serem consideradas (Tabela 1).
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Resolução taxonômica
A resolução taxonômica do sequenciamento 16S/ITS depende das regiões variáveis visadas, do próprio organismo e do algoritmo de análise de sequências. Nos últimos anos, alguns métodos de correção de erros, por exemplo, DADA26, melhoraram drasticamente a precisão e a resolução taxonômica desta técnica. Com o DADA2, a resolução em nível de espécie para muitos organismos usando o sequenciamento regular 16S é agora uma realidade. Mas, em teoria, o seqüenciamento metagenômico por caçadeira pode alcançar a resolução em nível de cepa porque pode cobrir todas as variações genéticas. Embora na prática, a precisão da resolução em nível de estirpe ainda enfrenta desafios técnicos. Mesmo assim, o seqüenciamento metagenômico por espingarda atinge maior resolução em comparação ao seqüenciamento 16S/ITS.
Functional profiling
Se a análise da função metagenômica for um objetivo, a maioria dos pesquisadores rapidamente negligenciará o seqüenciamento 16S e ITS. Mas, há algumas ferramentas que podem inferir a função metabólica a partir de dados taxonômicos, por exemplo, PICRUSt7. Mas, em geral, o seqüenciamento metagenômico com shotgun é freqüentemente utilizado quando o perfil funcional é necessário devido à cobertura adicional de genes.
Cobertura microbial e tipo de amostra recomendado
Seqüenciamento com shotgun examina todo o DNA metagenômico enquanto o seqüenciamento 16S apenas 16S rRNA genes, que também sofre de cobertura primer incompleta. Consequentemente, o primeiro tem maior cobertura de domínio cruzado. Então, por que a Tabela 1 denota o seqüenciamento 16S/ITS como melhor em cobertura bacteriana e fúngica? Isto deriva da cobertura de espécies das bases de dados de referência disponíveis, porque a previsão taxonómica destas abordagens de sequenciação depende muito da base de dados de referência utilizada. Atualmente, a cobertura das bases de dados 16S/ITS é muito melhor do que as bases de dados de genes inteiros. Isto porque os genomas inteiros de micróbios associados ao microbioma humano são muito melhor estudados do que os genomas de micróbios associados a outros ambientes. É por isso que é recomendado o uso de seqüenciamento metagenômico por espingarda para amostras relacionadas a microbiomas humanos, como fezes e saliva, se o perfil taxonômico for o objetivo principal.
Além disso, o seqüenciamento metagenômico tem uma maior dependência da base de dados de referência. Por exemplo, se uma bactéria não tem um representante estreitamente relacionado na base de dados de referência 16S, você pode ser capaz de identificá-la em um nível filogenético superior ou como uma bactéria desconhecida. Mas, no caso da sequenciação metagenómica da caçadeira, se uma bactéria não tiver um parente próximo (um genoma do mesmo género) na base de dados do genoma de referência, é provável que a perca completamente. Por exemplo, o ZymoBIOMICS Spike-in Control I contém dois micróbios estranhos ao microbioma humano (Imtechella halotolerans e Allobacillus halotolerans), cujos genomas não estavam anteriormente disponíveis. Se você o espicaçar em uma amostra fecal e seqüência com seqüenciamento por espingarda, a maioria dos dutos bioinformáticos não os detectará completamente, a menos que você adicione manualmente esses dois genomas na base de dados de referência. Por outro lado, se analisados com sequenciamento 16S, eles serão identificados devido à presença de sua sequência 16S em bancos de dados de referência.
False positives
Error-correction tools, tais como DADA2, não só melhoram a resolução taxonômica do sequenciamento 16S/ITS, mas também melhoram a precisão. Isto é demonstrado ao seqüenciar o DNA da comunidade microbiana simulada (por exemplo, ZymoBIOMICS Microbial Community Standard). Todas as sequências 16S são recuperadas sem erros na sequência, ou seja, sem falsos positivos. Mas, com a sequência metagenómica de caçadeira, a menos que exista um genoma representativo perfeito na base de dados de referência para uma sequência microbiana, é provável que a análise bioinformática preveja a existência de múltiplos genomas “estreitamente relacionados”. Estes genomas estreitamente relacionados podem ser de diferentes espécies do mesmo género ou mesmo de géneros diferentes. Por exemplo, suponha que existem três micróbios intimamente relacionados, A, B, e C, e eles compartilham algumas seqüências em comum. A espécie A compartilha algumas sequências apenas com B e algumas outras apenas com C. Se a base de dados de referência contém apenas genomas de B e C, quando A foi sequenciada, a bioinformática irá prever que tanto B como C estão presentes. Por exemplo, tanto A como B podem ser cepas de Escherichia coli e C é Salmonella enterica; as seqüências exclusivamente compartilhadas por B e C podem originar-se de uma transferência horizontal de genes, o que é comum entre micróbios intimamente relacionados. Devido a isto, a sequência 16S/ITS é melhor em relação aos falsos positivos.
Interferência do ADN hospedeiro
A presença de demasiado ADN hospedeiro pode causar amplificação não específica no processo de preparação da biblioteca da sequência 16S e ITS, mas o impacto é controlável ajustando os ciclos de PCR e mudando os iniciadores. Por outro lado, a interferência do ADN hospedeiro é um problema muito mais difícil para a sequenciação metagenómica da caçadeira, embora o custo da sequenciação tenha diminuído drasticamente. Dependendo do tipo de amostra, algumas amostras podem conter >99% de ADN hospedeiro humano, o que não só aumenta o custo da sequência como também introduz incerteza na medição. É por isso que muitos pesquisadores pesquisam a depleção do DNA hospedeiro, por exemplo, HostZERO Microbial DNA Kit, antes da preparação da biblioteca de seqüenciamento de espingarda. Contudo, pode não haver ADN genómico microbiano suficiente para a sequenciação do ADN do hospedeiro após o esgotamento do ADN do hospedeiro, o que normalmente requer uma entrada mínima de 1ng. A interferência do DNA hospedeiro é a razão pela qual a sequenciação superficial da espingarda só é recomendada para amostras fecais humanas.
Entrada de ADN
A sequenciação metagenómica da espingarda requer no mínimo 1 ng de entrada de ADN, a sequenciação 16S/ITS é muito mais sensível com os mínimos de entrada sendo femtogramas ou até mesmo 10 cópias de genes rRNA 16S.
Aqui para ajudar
A escolha entre sequenciamento 16S e sequenciamento metagenómico de caçadeira é um passo crítico para todos os estudos microbiológicos. Além do orçamento, muitos aspectos do projeto precisam ser considerados, incluindo o tipo de amostra, análises desejadas, resolução taxonômica e organismos alvo. Levar estas considerações em consideração o ajudará a escolher o método de seqüenciamento correto para o seu próximo projeto microbiológico. Os serviços de sequenciamento microbiológico ZymoBIOMICS oferecem 16S, ITS e shotgun sequencing como serviços completos de extração de DNA através de sequenciamento e bioinformática. Os especialistas em sequenciamento e bioinformática da Zymo Research estão felizes em ajudá-lo a escolher o método de sequenciamento certo para seu estudo.
Descubra qual método de sequenciamento é melhor para você. Fale com os especialistas que fornecem os Serviços de Sequenciação ZymoBIOMICS.
Saiba Mais
1. Laudadio I, Fulci V, Stronati L, Carissimi C. Metagenómica da Próxima Geração: Desafios Metodológicos e Oportunidades. Omics a Journal of Integrative Biology 2019 23(7): 327-333.
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3. Kim D, Song L, Breitwieser FP, Salzberg SL. Centrifugação: classificação rápida e sensível de sequências metagenómicas. Genome Research 2016 26(12): 1721-1729.
4. Segata N, Waldron L, Ballarini A, Narasimhan V, Jousson O, Huttenhower C. Perfil da comunidade microbiana metagenómica usando genes únicos de marcadores específicos de clade-específicos. Nature Methods 2012 9(8): 811-814.
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13 de Novembro de 2019