Análise e descrição dos estágios de formação do biofilme do Aspergillus fumigatus usando microscopia eletrônica de varredura

De uma perspectiva médica, Aspergillus fumigatus é um patógeno oportunista de indivíduos imunocomprometidos, com uma gravidade da doença que depende do estado imunológico do hospedeiro, demonstrando uma taxa de mortalidade de 50-95 %. Este fungo dá origem a infecções locais, tais como dermatomicoses de unhas ou ceratite fúngica, e a infecções invasivas, como a aspergilose, e compreende a segunda causa mais comum de infecções fúngicas em doentes hospitalizados. A. A infecção por fumigatus no trato respiratório pode causar bola fúngica pulmonar, aspergilose invasiva, aspergilose pulmonar invasiva (IPA), pneumonia hipersensível, asma, rinite alérgica mediada pela imunoglobulina E, pneumonia necrosante crônica ou aspergilose broncopulmonar alérgica (ABPA). Além disso, dá origem a osteomielite e endocardite.

A. fumigatus desenvolve um biofilme que pode ser um dos factores de virulência mais importantes . A. fumigatus biofilm elabora micélios embutidos em um EMC in vitro, e a formação do biofilme tem sido descrita em células epiteliais brônquicas humanas (HBE) e células epiteliais brônquicas de fibrose cística (CFBECs) e em pacientes com fibrose cística . A formação de biofilme fúngico em cateteres e próteses contribui para o desenvolvimento de infecções nosocomiais. Portanto, a persistência de infecções fúngicas ocorre devido à capacidade de um fungo formar biofilmes em uma grande variedade de dispositivos médicos e porque as células persistentes representam um importante mecanismo de resistência. A terapia submetida a um biofilme estabelecido no hospedeiro geralmente requer a administração de concentrações tóxicas de antimicrobianos, e o tratamento recomendado inclui a remoção do dispositivo contaminado; contudo, este é um processo difícil e dispendioso. Portanto, os biofilmes fúngicos são um grande problema clínico e econômico .

Na última década, vários estudos foram publicados sobre o biofilme do A. fumigatus, tanto in vivo (em modelos murinos, em pacientes com aspergilose pulmonar invasiva e em culturas epiteliais humanas primárias) quanto in vitro (em placas de poliestireno). Em geral, estes estudos envolvem principalmente o estágio de maturidade do biofilme e a composição química do ECM, com poucas imagens dos estágios do biofilme, mas qualquer um destes descreve todos os estágios de formação do biofilme. Assim, as informações são diferentes das contribuições feitas pelo nosso grupo de trabalho .

As contribuições mais importantes deste estudo são as seguintes: i) nós fornecemos uma descrição de cada estágio na formação do biofilme de A. fumigatus in vitro, ao longo do tempo, e as etapas são suportadas por imagens SEM; ii) analisamos duas origens diferentes de isolados: um do meio ambiente e outro de um paciente com úlcera corneana; iii) relatamos micro-hifas (isolados clínicos) e estruturas fúngicas que, até o momento, quase não foram relatadas e que não foram descritas, ao nosso conhecimento, para as espécies Aspergillus; e iv) fornecemos uma descrição da etapa de dispersão para a formação da colonização do biofilme em novos pontos.

Para analisar a organização estrutural do biofilme maduro de A. fumigatus (24 h de incubação a 28 °C e 37 °C), duas cepas, uma do solo e outra de um paciente com ceratite fúngica, foram examinadas pela SEM. Uma visão geral da formação do biofilme de A. fumigatus observada nesta pesquisa foi que estes biofilmes se comportaram de forma semelhante, independentemente de o isolado ser do solo ou da clínica; entretanto, as diferenças se apresentaram de acordo com a temperatura de incubação. A 28 °C, o biofilme apresentou estágios semelhantes aos descritos no crescimento microbiano clássico: o desfasamento, fases exponenciais e estacionárias; o crescimento do biofilme foi lento e estável com baixa produção de ECM, e a organização estrutural fúngica foi simples (Fig. 1). A 37 °C, a curva de desempenho mostrou uma fase de defasagem (adaptação) e log (exponencial) bastante variável, que poderia estar em resposta ao estresse devido à incubação a alta temperatura; assim, a 37 °C há uma redução da fase de adaptação (lag) para manter um fungo viável; também, a fase log, com um aumento descontínuo e com ambos os comportamentos é provavelmente uma resposta adaptativa. Assim, a 37 °C durante a fase de maturação, havia estruturas micelianas extremamente organizadas, e estas foram reduzidas e compactadas com hifas que foram espessadas e fundidas em anastomose, e o ECM foi abundante em sua cobertura, entorno e fortalecimento das estruturas fúngicas (Figs. 3 e 4).

Neste estudo, nós fornecemos evidências dos estágios do biofilme do A. fumigatus por SEM. Os estágios observados durante a formação do biofilme foram os seguintes:

A aderência, co-agregação celular e produção de EPS

Em um estágio inicial (Fig. 2/4 h), as conidias aderem à superfície da placa através de uma interação de forças eletrostáticas entre os componentes estruturais da parede celular fúngica, e esta força de atração é fraca e, portanto, reversível. A ligação irreversível e permanente tem sido amplamente descrita em adesivos bacterianos específicos presentes na superfície celular, que se ligam ao substrato e ao EPS, que são substâncias produzidas pelo microorganismo nos estágios iniciais da formação do biofilme que funcionam na adesão das células umas às outras e ao substrato e são compostos por complexos proteína-carboidrato e glicoproteínas que realizam principalmente funções estruturais ou adesivas. As adesinas estão envolvidas no reconhecimento das células bacterianas entre si, incluindo a construção de pontes e o início da formação de colónias. As adesinas são descritas na adesão fúngica durante a formação do biofilme. Nos biofilmes Candida albicans, Candida glabrata e Candida tropicalis, existe um grupo de genes de adesão envolvidos na formação do biofilme que estão na família da sequência de aglutinina (ALS), que desempenha um papel fundamental neste processo e codifica as proteínas que possuem as características das glicoproteínas adesivas na superfície celular. A família ALS presente na C. albicans inclui oito genes (ALS1-ALS7 e ALS9) que codificam muitas glicoproteínas de superfície. Em A. fumigatus, seis hidrofobinas, compreendendo as RodAp, RodBp, RodCp, RodDp, RodEp e RodFp, foram identificadas na superfície da conidia. Esta característica hidrofóbica permite a adesão às proteínas das células hospedeiras, podendo estas estar envolvidas na adesão à superfície da placa de poliestireno e no início do processo de formação do biofilme em todas ou apenas em duas ou três destas . Além disso, Gravelat e colegas de trabalho descreveram esta interação fúngica, e descobriram que a aderência MedA controla a aderência à placa de poliestireno, a formação do biofilme e a expressão dos genes de conidiação e que tem efeitos duros sobre o processo de conidiação em A. fumigatus . A adesão, resultante da interação entre as aderências fúngicas e a superfície da placa, e a adesão conidium-conidium provavelmente desencadeia a sinalização e promove a co-agregação celular e a produção de EPS, e estes eventos são apresentados na Fig. 2 (4 h). Ao mesmo tempo, o EPS acelera a formação de colônia fúngica pela ligação hermética das células (Fig. 2 (8-12 h)) .

Germinação sidial em hifas e desenvolvimento

Formação de biofilme requer um número limite de células para permitir a detecção e a geração de uma resposta, que é um mecanismo regulador da expressão gênica com funções específicas . Em A. fumigatus a formação do biofilme, antes do início da germinação conidial, a superfície da conidia é marcadamente hidrofóbica e é composta de 40% de grupos metilo hidrofóbicos. A. fumigatus germinação conidial resulta na ruptura da camada hidrofóbica do proteináceo e revela paredes internas do conídio que são essencialmente compostas por polissacarídeos, que são componentes da parede celular hidrofílica. Existe uma ponta hidrofóbica em um único esporo germinativo. O conídio perde progressivamente a sua hidrofobicidade superficial e, depois disso, o novo ponto de crescimento apresenta uma coexistência de hastes hidrofóbicas e polissacáridos hidrofílicos. A germinação conidial em hifas começa com a formação do tubo germinal, como ilustrado na Fig. 2 (8-12 h), possuindo a própria natureza hidrofílica da parede celular, e espera-se que favoreçam o crescimento hifálico .

Maturação do biofilme

A. maturação do biofilme fumigatus foi observada às 24 h, que é um tempo de incubação semelhante aos relatados por outros pesquisadores. Os componentes estruturais incluem o ECM, que está presente no biofilme maduro e liga as células para formar a base estrutural do biofilme, incluindo o EPS e muitos micélios organizados (Fig. 2 (24 h0) . ECM. A água compreende o componente mais abundante e, no biofilme, é quase 97%. Neste ambiente úmido, existe uma rede macromolecular ordenada. As principais funções descritas para o EPS nos biofilmes bacterianos são: adesão, agregação celular, coesão; retenção de água, uma barreira protetora como defesas específicas do hospedeiro ou agentes antimicrobianos, absorção de compostos orgânicos e íons inorgânicos, atividade enzimática, fonte de nutrientes, troca de informação genética, doador ou aceitador de elétrons, exportação de componentes celulares, armazenamento de excesso de retenção de energia e estabilização de enzimas . Nos biofilmes fúngicos, todas estas funções ainda não estão descritas, mas algumas delas estão sendo estudadas: as forças coesivas e adesivas da matriz contribuem para a estabilidade arquitetônica e mecânica do biofilme. As células fúngicas são imobilizadas na matriz e actuam como um ecossistema funcional em constante mudança e regulação homeostática com interacções intensas, incluindo a comunicação entre células, que actua como a cola que mantém as células unidas . A estrutura do biofilme varia muito de acordo com o microorganismo que o produz e as condições que envolvem os seus microhabitats, incluindo as diferenças estruturais associadas à apresentação clínica. Durante os processos infecciosos, o ECM apoia a protecção contra o hospedeiro, bem como a resistência aos medicamentos por parte dos microrganismos; assim, o ECM não é apenas uma estrutura mecânica, mas é também um regulador do comportamento celular. As proteínas hidrofóbicas da matriz estão ligadas aos receptores específicos da superfície celular que resultam na adesão celular-matriz, o que exerce um efeito na forma celular, migração, proliferação, sobrevivência celular e metabolismo. Além disso, o ECM protege as células contra insultos ambientais, incluindo secagem, Ultravioleta (UV), radiação, oxidação, fome, a ação de predadores e defesas imunológicas e antibióticos do hospedeiro. As características do ECM foram evidentes nas Fig. 2 (24 h) e Fig. 3 e aderiram às hifas fúngicas em uma bainha contígua e também foram observadas com consistência porosa (Fig. 2 (24 h)). No biofilme do A. fumigatus, o EPS era altamente estruturalmente organizado e tinha uma produção abundante, que cobria, envolvia e fortalecia as estruturas fúngicas; ele atua como um coeso para a fusão das estruturas das hifas-hifas (apenas 37 °C). O EPS ocorre com um aspecto mucoso que adere completamente e cobre as hifas, causando anastomose e fechando a luz dos canais de água (Fig. 2 (24 h), 3, e 4). Em estudos anteriores, nosso grupo de trabalho descreveu o estágio de maturação do biofilme A. fumigatus, no qual estruturas semelhantes foram observadas .

Em alguns microconsórcios, a composição química do EPS é conhecida (polímeros de carboidratos, DNA e/ou proteínas e, lipídios, entre outros), mas outros ainda não foram identificados. A superfície do A. fumigatus’-surface é composta por α-1,3-glucanos, quitina, quitosano, galactomanano, galactosaminogalactano, melanina, e proteínas. A composição e organização estrutural da parede celular é constantemente remodelada; embora os polissacarídeos presentes sejam os mesmos, sua quantidade e localização variam com as condições de crescimento e ambiente nutricional. Aqui, mostramos a composição química do biofilme de A. fumigatus, que foi observada pela co-localização dos fluorocromos ligados à quitina, atividade metabólica e ácidos nucléicos pelo CLSM; além disso, a sobreposição dos sinais de fluorocromos foi observada quando estes anexaram dois ou três destes (Fig. 5). A função descrita para os polissacarídeos, como α 1,3-glucanos, compreendeu o seu papel predominante in vitro na agregação hifalina e na agregação hifalina em biofilmes. Outros polissacáridos do ECM, incluindo galactomanano e galactosaminogalactano são também conhecidos por possuírem um papel na protecção do fungo, e na aderência das suas estruturas de biofilme às superfícies. O DNA extracelular (eDNA) é um componente importante do biofilme ECM que mantém a integridade estrutural e arquitetônica do A. fumigatus. O eDNA é criado por autólise e tem sido significativamente associado aos níveis de resistência antifúngica (Fig. 5). Além disso, o eDNA pode ser um reservatório de genes para a transferência horizontal de genes. O DNA confere uma organização estrutural mais sólida e resistente quando é co-localizado com polissacarídeos. O eDNA deriva de células fúngicas devido à secreção de quitinases por A. fumigatus, favorecendo sua liberação (Fig. 5) . No biofilme, a modificação da parede celular exerce um impacto essencial na resistência aos fármacos da parede celular. Em A. fumigatus, num modelo de biofilme de rato, em bombas de efluxo multirresistentes (MDR) AfuMDR4 genes associados com a saída de antimicrobianos, o gene foi significativamente induzido pelo tratamento com Voriconazole após 24 h . O marcador FUN1 revelou atividade metabólica que é uma comunidade viva (Fig. 5).

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Micélia: O biofilme mostra uma estrutura complexa tridimensional (3-D) que reflete um processo celular coordenado; o desenvolvimento e expansão micelial foram evidentes, que incluiu redes compactadas de camada hifálica, adesão de hifa/hifa, anastomose em ambas as temperaturas, com canais formados por arranjos espaciais ideais para fornecer influxo de nutrientes e efluxo de produtos residuais e assim estabilizar o biofilme; a 37 °C, este canal era mais evidente (Figs. 2 (24 h), 3, e 4). Além disso, essas estruturas foram observadas por outros pesquisadores. Microhyphae: Nos estágios iniciais de maturação do biofilme, foram observadas estruturas fúngicas irregulares, como as micro-hifas, no isolado clínico (Fig. 4). Este fato é relevante porque há poucas referências a micro-hifas na literatura, e esta é a primeira vez que elas foram descritas em A. fumigatus. As micro-hifas apresentam alterações de citoesqueleto que geram hifas curtas e esbeltas com paredes finas e com extremidades dobradas. As micro-hifas estão associadas a uma alta atividade enzimática que favorece o processo de maturação e o subsequente estágio de dispersão celular do biofilme .

Dispersão celular

Durante a dispersão celular, uma porção do biofilme é descolada, a porção que compreende a conidia ou hifas. O desenvolvimento assíncrono do biofilme foi observado, especialmente na fase de maturidade do biofilme, quando as novas conidias eram capazes de germinar, produzindo novo crescimento micelial e modificações hifais, tais como cachos (Figs. 4 e 6). A dispersão celular do biofilme ocorre em resposta às mudanças ambientais. Isso atua para remover uma substância perigosa do corpo principal do biofilme. Este processo leva à disseminação e propagação das células do biofilme residente em um novo local, que é suportado por eventos moleculares complexos . Os biofilmes podem ser vistos como conchas protetoras das células vivas por baixo, com extrema complexidade e inúmeras funções, e, portanto, são construções biológicas verdadeiramente notáveis. Os biofilmes fornecem proteção contra predação ou ataque químico e fornecem às células internas um meio de comunicação intracelular, fluxo de nutrientes e transferência de material genético. A dispersão celular dissemina células viáveis para outros locais no ambiente ou dentro de um hospedeiro onde as células podem se reproduzir, facilitando assim a sua persistência. A dispersão celular ocorre como resultado de condições ambientais escassas de nutrientes e, portanto, é um mecanismo de sobrevivência. Portanto, a dispersão celular é importante não só para promover a diversidade genética, mas também para escapar de habitats desfavoráveis, ajudando no desenvolvimento de novos nichos e na persistência do microorganismo em um novo local .