Antisense Oligonucleotidees Targeted to SMN2
ASOs são ácidos nucleicos de cadeia única sintetizados para serem complementares a uma sequência alvo de RNA. Uma vez administrado, o ASO é levado para a célula através de um mecanismo endocítico ainda mal definido e então entra no núcleo onde se liga ao seu alvo pré-mRNA.62 Inicialmente, os ASOs foram usados para suprimir a expressão gênica bloqueando a tradução de um alvo de RNA ou promovendo sua degradação. Atualmente, os ASOs também podem ser projetados para alterar o processamento ou emenda de um alvo. Os ASOs terapêuticos SMA são concebidos para modificar a emenda alterativa do SMN2 pré-mRNA de modo a que o exon 7 seja incluído na transcrição final processada. Como discutido nos capítulos anteriores, o SMN2 difere do SMN1 por uma transição de C para T que ocorre seis nucleotídeos no exon 7 (existem outras diferenças entre as duas sequências, mas esta é a funcionalmente mais importante). A transição C-to-T cria um contexto inibitório estendido no exon 7 (também conhecido como “Exinct”).63 Uma vez que o exon 7 é definido de forma fraca devido a um site de emendas fraco em 5′, a mutação C-to-T no SMN2 é suficiente para fazer pender o saldo da sua inclusão para a exclusão.
Os elementos reguladores de emenda desempenham um papel importante na determinação dos sites que são reconhecidos pelas máquinas de emenda celular. A localização e função dos elementos relevantes do SMN2 foram identificados pela análise do efeito de emenda de uma extensa série de ASOs projetados para complementar a seqüência SMN2 de forma iterativa progressiva.63-66 O silenciador de emenda intrônico ISS-N1 foi identificado como um elemento silencioso muito poderoso através deste método; o motivo está localizado abaixo do site 5′-splice do exon 7 e se liga ao emenda repressor hnRNP A1.66-68 ASOs foram projetados para induzir de forma confiável a inclusão do exon 7, visando o ISS-N1 ou outros elementos regulatórios.
ASOs podem ser projetados para serem bifuncionais. Por exemplo, ASOs quiméricos que fundem domínios de recrutamento de SR (peptídeo RS) a uma sequência anti-senso que suprime motivos silenciosos têm demonstrado aumentar a inclusão exon 7 e os níveis de proteína SMN nos fibroblastos dos pacientes; uma única injeção do ASO bifuncional foi capaz de induzir a proteína SMN no cérebro de camundongos neonatais e resultou em uma vida útil prolongada.65,69 Esta estratégia de design ASO, conhecida como ESSENCE (exon specific splicing enhancement by small chimeric effectors), foi inicialmente seguida na terapêutica de AME, mas estudos posteriores mostraram que o peptídeo RS não era necessário para alcançar um efeito robusto na inclusão do SMN2 exon 7. Como uma abordagem quimérica introduz dificuldades na fabricação do ASO e limita a permeabilidade celular do ASO, ASOs bifuncionais não foram testados extensivamente em ratos e não estão atualmente sendo desenvolvidos clinicamente.62
Once ASOs visando ISS-N1 mostraram ser notavelmente eficazes na promoção da inclusão do exon 7, a próxima questão estratégica foi identificar qual a espinha dorsal do ASO seria melhor utilizada em uma potencial terapia de AME. Os oligonucleotídeos que compõem um ASO são tipicamente modificados para otimizar propriedades farmacêuticas como a absorção celular, toxicologia, farmacocinética e ligação ao alvo. Uma adaptação comum, que surgiu de uma colaboração entre a Ciba-Geigy Ltd. (agora conhecida como Novartis) e Isis Pharmaceuticals (agora conhecida como Ionis Pharmaceuticals), é a 2′-O-methoxyethyl (2′-MOE), que aumenta tanto a resistência do ASO à degradação da nuclease como a afinidade da hibridação.70 2′-MOE oligonucleotides foram comprovadamente muito seguros em roedores e primatas, incluindo humanos.62 A administração de um 2′-MOE ASO bloqueador do ISS-N1 aumentou com sucesso o SMN2 exon 7 de forma dose- e dependente do tempo em ratos SMA, melhorando a patologia neuromuscular e aumentando dramaticamente a sobrevivência.68,71,72 A Ionis Pharmaceuticals, em colaboração com a Biogen, está desenvolvendo uma terapia 2′-MOE ASO chamada nusinersen (também conhecida como IONIS-SMNRx e anteriormente chamada ISIS-SMNRx). Estudos pré-clínicos de nusinersen em primatas não humanos demonstraram que uma única injeção intratecal poderia resultar nas concentrações teciduais necessárias para melhorias significativas na inclusão do exon 7 e essas concentrações foram mantidas por vários meses.62 A longa meia-vida do medicamento significa que os pacientes podem necessitar apenas de uma injeção intratecal a cada poucos meses.73 Em um estudo de fase 1 com rótulo aberto em pacientes com AMS tipo II/III de 2-14 anos de idade, uma única injeção de nusinersen foi bem tolerada e parece ter se correlacionado com o aumento dos escores de HFMSE na dose mais alta.74 Em junho de 2015, a Ionis liberou novos dados de um estudo em andamento de fase 2 de nusinersen em bebês do tipo I, que mostrou que os bebês viveram mais tempo e alcançaram mais marcos motores do que normalmente seria esperado da história natural da doença.75 Além disso, o mecanismo de ação do medicamento foi apoiado por dados mostrando um aumento na quantidade de mRNA SMN2 e proteína SMN no cérebro e nos tecidos da medula espinhal a partir de autópsias de pacientes que receberam tratamento. A Ionis também liberou dados do seu estudo de extensão do rótulo aberto fase 2 em crianças com AME tipo II/III mostrando que 57% dos sujeitos conseguiram pelo menos uma melhora de três pontos no HFMSE e uma melhora média de 55 m no Teste de Caminhada de 6 Minutos (TC6MW).76 Estudos da Fase 3 de nusinersen estão sendo realizados atualmente tanto em bebês quanto em adultos com AME (NCT02193074; NCT02292537); os resultados devem estar disponíveis em 2017.
Embora ainda não tenham sido observados problemas de segurança com o uso do 2′-MOE na terapia de AME, algumas toxidades têm sido associadas ao 2′-MOE ASOs em outras populações de pacientes.77,78 Outra modificação da espinha dorsal a ser explorada para uso em SMA que pode contornar estas questões é o oligómero morfolino fosforamidato (PMO). As OMP têm se mostrado mais eficazes do que 2′-MOE em modelos de camundongos da distrofia muscular de Duchenne (DMD), outra doença neuromuscular pediátrica, e também foram bem toleradas em pacientes com DMD.79 Uma injeção de VCI de ASOs morfolino complementar ao ISS-N1 melhorou significativamente a sobrevida de camundongos com AME sem sinais de toxicidade do sistema nervoso central (SNC).80,81 Um morfolino direcionado ao ISS-E1, um silenciador de emenda intrônica encontrado a montante do exon 7, também melhora o fenótipo dos ratos SMA.82 Esta abordagem ainda não foi levada à clínica.
A química da espinha dorsal de um ASO pode impactar a adequação a vários métodos de entrega, a necessidade de repetição de dosagem e conferir toxicidade associada – tudo isso tem implicações importantes para o seu uso terapêutico. Além disso, um ASO usado para tratar AME deve permanecer farmacologicamente ativo nos tecidos do SNC, particularmente nos neurônios motores. Independentemente da espinha dorsal, qualquer ASO projetado para terapia de AME provavelmente precisará ser administrado diretamente ao líquido cefalorraquidiano via injeção intratecal. Embora alguns estudos usando a administração periférica de ASO em camundongos neonatais tenham mostrado eficácia, a barreira hematoencefálica não é totalmente formada em camundongos jovens e um ASO administrado perifericamente é capaz de penetrar no SNC a um grau que não é possível em humanos.71 Encorajadoramente, ASOs injetados intratecalmente têm mostrado distribuição ampla entre tecidos importantes do SNC, como neurônios motores, astrocitos e microglia.72,83-85
Embora a injeção intratecal seja um tanto invasiva e exija sedação ou anestesia, as ASOs têm várias vantagens significativas sobre outras modalidades experimentais, incluindo alta especificidade de alvo, eficácia notável, pouca toxicidade em comparação com a entrega sistêmica de ASOs, e processos de fabricação relativamente simples em comparação com os biológicos (mas não pequenas moléculas). Mais informações podem ser encontradas no Capítulo 18.