- Descrição do sistema de semi-campo e áreas de estudo para experiências de campo
- Mosquitos
- Mosquito armadilhas e iscas
- Procedimentos de estudo
- Testes de semi-campo para comparar a eficácia da armadilha Mosclean, armadilha com luz CDC, armadilha de aterragem humana (HLC), armadilha BG-Sentinel e armadilha Suna
- Testes de campo para comparar as eficiências da armadilha Mosclean, armadilha com luz CDC, armadilha BG-Sentinel e armadilha Suna
- Análise de dados
Descrição do sistema de semi-campo e áreas de estudo para experiências de campo
Experimentos foram conduzidos tanto em configurações de semi-campo como de campo. Todos os testes de semicampo foram feitos dentro de uma grande casa de tela com várias câmaras (28,8 × 21 m) no Ifakara Health Institute , Ifakara, Tanzânia. Usamos um compartimento medindo 9,6 × 21 m no qual havia duas cabanas experimentais com uma área peri-doméstica composta de diferentes tipos de vegetação e seixos, para imitar a habitação local e a configuração ecológica .
Os testes de campo foram conduzidos em aldeias no Distrito de Ulanga, sudeste da Tanzânia, aproximadamente 20 km ao sul da cidade de Ifakara (Fig. 1). A área situa-se nas planícies de inundação de Kilombero, entre as montanhas Udzungwa ao norte e as colinas de Mahenge ao sul. As principais actividades económicas incluem a agricultura (principalmente o cultivo de arroz e milho), a pesca e o comércio em pequena escala. A precipitação anual varia de 1200 a 1800 mm e as temperaturas de 22 a 32,6 °C. Chuvas curtas ocorrem de Novembro a Dezembro, enquanto que chuvas longas ocorrem entre Março e Junho.
Mapa mostrando aldeias de estudo no distrito de Ulanga, sudeste da Tanzânia (cortesia de Alex J. Limwagu)
Mosquitos
Os mosquitos usados eram de colônias da linhagem Ifakara de Anopheles arabiensis, originalmente estabelecida em 2009 com espécimes da aldeia de Lupiro, aproximadamente 25 km ao sul da cidade de Ifakara. A colónia é mantida a 27 ± 2 °C e 75 ± 10% de humidade relativa (HR), como descrito anteriormente por Batista et al. . As larvas são cultivadas em bacias de plástico e alimentadas duas vezes por dia com alimento para peixes Tetramin® (Tetra GmbH, Melle, Alemanha). Os adultos são alimentados com solução de glucose a 10%. A manutenção das colónias também envolve refeições de sangue ad libitum dadas às fêmeas através de braços voluntários humanos. Os testes de campo, no entanto, visaram mosquitos selvagens de diferentes espécies das aldeias estudadas.
Mosquito armadilhas e iscas
A principal armadilha de teste candidata foi a armadilha Mosclean, que emite 365 nm UV utilizando a tecnologia violeds™ e gera gás CO2 através de uma reacção fotocatalítica nas superfícies das placas de TiO2. O armadilha mede 20 cm (diâmetro) e 28,8 cm (altura) e funciona com corrente contínua ou alternada. Eles podem operar com pequenas células solares portáteis para carregar uma bateria portátil para uso em locais sem eletricidade.
Como mostrado na Fig. 2a, o alçapão tem cinco componentes: (i) uma placa de telhado, que tem uma etiqueta de suspensão para pendurar a armadilha e uma sombra para otimizar o desempenho dos LEDs UV; (ii) um ventilador de baixa potência, baixo ruído e alta eficiência para sucção de mosquitos; (iii) uma placa de LEDs UV, emitindo luz ultravioleta a um comprimento de onda de 365 nm para atrair mosquitos; (iv) um recipiente para capturar mosquitos presos; e (v) um fotocatalisador, que de acordo com o fabricante libera gás CO2 para complementar a atração dos mosquitos. Não testamos a produção de CO2 por estas armadilhas durante as nossas experiências, mas avaliamos as armadilhas tal como foram obtidas do fabricante.
a Vista esquemática da armadilha Mosclean. b Imagem de grande plano da armadilha Mosclean. Esquema cortesia de Seul Viosys
A eficácia da armadilha Mosclean foi comparada com as de outras armadilhas existentes comumente usadas para amostragem de mosquitos Anopheles e culicines de interior e exterior. A primeira armadilha foi a armadilha com luz CDC, amplamente utilizada para a captura de mosquitos de interior. A armadilha luminosa CDC usa uma lâmpada incandescente como principal atrativo e funciona com um ventilador motorizado alimentado por uma bateria . A segunda foi a armadilha BG-Sentinel (Biogents GmbH, Regensburg, Alemanha) . A armadilha consiste num balde dobrável azul escuro, uma tampa perfurada branca, um funil de entrada, um saco de recolha e um ventilador alimentado por uma bateria . Tem 36 cm de diâmetro e 40 cm de altura. A última armadilha de comparação foi a armadilha Suna (Biogents GmbH), que tem 52 cm de diâmetro e 39 cm de altura, e também funciona com bateria. A armadilha Suna foi descrita e otimizada pela primeira vez no oeste do Quênia em 2014 e demonstrou alta eficácia contra os mosquitos An. funestus na Ilha Rusinga. Recentemente foi utilizada no Malawi para amostragem de mosquitos dentro e fora de casa .
As armadilhas BG-Sentinel e Suna são comumente usadas para amostragem de mosquitos ao ar livre, e são frequentemente iscas com iscas proprietárias BG, gás CO2 ou outras iscas . Neste estudo, o CO2 foi obtido, sempre que necessário, a partir da fermentação de melaço de levedura, e utilizado nas diferentes armadilhas de comparação, conforme detalhado abaixo. A mistura de leveduras-molaços foi preparada 30 minutos antes do início das experiências, misturando 40 g de levedura de panificação e 500 ml de melaço dissolvido em 2 L de água, e os gases efluentes canalizados através de tubos plásticos para os sifões . Como referência padrão, os HLCs, realizados por voluntários adultos do sexo masculino, também foram usados em testes de semi-campo, mas não nos testes de campo, pois os mosquitos selvagens podem ser infecciosos.
Procedimentos de estudo
Testes de semi-campo para comparar a eficácia da armadilha Mosclean, armadilha com luz CDC, armadilha de aterragem humana (HLC), armadilha BG-Sentinel e armadilha Suna
Os experimentos foram conduzidos dentro dos compartimentos de semi-campo todas as noites das 18:00 às 06:00 h. A cada noite, 400 fêmeas nulíparas de An. arabiensis com 3-6 dias de idade e não previamente alimentadas com sangue foram liberadas dentro da câmara da casa da tela. Os mosquitos de teste foram esfomeados por 6 h antes de cada teste e foram liberados dentro das câmaras 30 min antes de iniciar os testes para aclimatação no ambiente. As cabanas eram limpas todas as manhãs (utilizando um aspirador Prokopack) e as armadilhas eram monitorizadas para uma funcionalidade óptima.
- (i)
Testes para comparar a armadilha Mosclean e a armadilha luminosa CDC usando um hospedeiro humano sob uma rede mosquiteira como isca
Primeiro, comparamos a armadilha Mosclean com a armadilha luminosa CDC para armadilhas interiores em testes com as duas armadilhas dentro da mesma câmara nas mesmas noites, de tal forma que as armadilhas estavam competindo pelos mesmos mosquitos. Uma armadilha Mosclean foi suspensa dentro de uma das cabanas experimentais, ao lado de uma rede mosquiteira não tratada ocupada por um macho adulto adulto voluntário adormecido (Fig. 3b). Da mesma forma, uma armadilha com luz CDC foi suspensa dentro da outra cabana, também ao lado de uma rede mosquiteira ocupada por um voluntário (Fig. 3a). As armadilhas estavam 150 cm acima do solo e perto dos pés dos voluntários. A armadilha luminosa CDC e a Mosclean foram rodadas entre as cabanas durante a noite, para evitar o viés posicional. Os voluntários, entretanto, mantiveram suas posições de tal forma que sua atratividade diferencial individual foi combinada às respectivas características da barraca para constituir uma única fonte de variação experimental. A cada noite, 400 fêmeas do mosquito An. arabiensis eram liberadas de um local central dentro da câmara semi-campo, equidistantes das duas cabanas. O número total de mosquitos capturados em cada armadilha durante a noite foi registrado e as armadilhas foram limpas. O teste foi repetido durante 12 noites, sendo cada armadilha em cada cabana seis vezes.
Imagens da armadilha montada durante a experiência de semi-campo, uma armadilha CDC-Light montada dentro de casa ao lado de uma cama com rede mosquiteira. b Armadilha Mosclean dentro de casa ao lado de uma cama com rede mosquiteira. c Armadilha BG-Sentinel montada ao ar livre. d Armadilha Suna montada ao ar livre
- (ii)
Testes para comparar a armadilha Mosclean e HLCs usando hospedeiro humano sob uma rede mosquiteira
O segundo teste comparou a armadilha Mosclean e HLCs, também de forma competitiva. Em uma cabana, uma armadilha Mosclean foi colocada ao lado de uma rede ocupada por voluntários, como acima (Fig. 3b), enquanto na segunda cabana, a HLC foi conduzida na mesma noite por um voluntário adulto do sexo masculino. Os voluntários sentaram-se dentro de casa, dobrando as calças para apanhar mosquitos que aterravam nas pernas usando aspiradores bucais. Desta forma, os dois métodos de armadilhagem competiam pelo mesmo mosquito. A armadilha Mosclean e HLC eram giradas entre as cabanas durante a noite, mas os voluntários ficavam nas mesmas cabanas. Todas as noites, 400 fêmeas do mosquito An. arabiensis eram libertadas de um local central dentro da câmara semi-campo, equidistantes das cabanas. Os mosquitos capturados por HLC ou armadilhas Mosclean foram registrados e comparados. O teste foi repetido durante 12 noites, sendo cada método em cada cabana seis vezes.
- (iii)
Testes não competitivos da armadilha Mosclean e HLC, usando hospedeiro humano sob uma rede mosquiteira como isca
No terceiro teste, a armadilha Mosclean foi testada independentemente contra HLC em noites separadas para evitar competição direta entre as armadilhas para o mesmo mosquito. A armadilha foi colocada dentro da primeira cabana (escolhida aleatoriamente) e depois deslocada para a segunda cabana na segunda noite. Na terceira e quarta noites, a HLC foi conduzida dentro da primeira ou segunda cabana, numa ordem aleatória. Esta sequência foi aleatória para que os testes começassem com a HLC ou com a armadilha Mosclean, e também foi replicada seis vezes. A cada noite, 400 fêmeas do mosquito An. arabiensis eram liberadas de um local central dentro da câmara semi-campo. Foram registrados números de mosquitos capturados a cada noite por cada tipo de armadilha na ausência de uma alternativa concorrente.
- (iv)
Testes para comparar diretamente a armadilha Mosclean com armadilhas externas comumente usadas, ou seja Armadilhas Suna e BG-Sentinel
Ao contrário dos três primeiros testes, a armadilha mosquiteira nesta experiência foi conduzida ao ar livre, mas dentro das câmaras semi-campo durante quatro ciclos nocturnos, usando um quadrado 4 × 4 latino aleatório. Foram utilizadas duas variantes diferentes da armadilha Mosclean, a primeira sem qualquer isca adicional, e a segunda isca com CO2 adicional proveniente da fermentação de melaço de levedura. A armadilha Suna (Fig. 3d) e BG-Sentinel (Fig. 3c) também foram iscadas com CO2 da fermentação de melaço de levedura. Os quatro tipos de armadilhas, armadilha Mosclean padrão, armadilha Mosclean com CO2, armadilha Suna com CO2 e armadilha BG-Sentinel com CO2 foram girados durante a noite de forma aleatória através dos quatro locais externos dentro da câmara semi-campo durante quatro ciclos noturnos. Um total de 600 An. arabiensis fêmeas foram liberadas a cada noite em um local central equidistante de cada posição da armadilha e as capturas registradas a cada manhã. A experiência foi replicada sete vezes em 28 noites, durante as quais cada tipo de armadilha tinha estado em cada local sete vezes.
Testes de campo para comparar as eficiências da armadilha Mosclean, armadilha com luz CDC, armadilha BG-Sentinel e armadilha Suna
Four diferentes experimentos de campo foram conduzidos da seguinte forma:
- (i)
Comparação das eficácias das armadilhas mosquiteiras Mosclean e CDC para a amostragem de mosquitos que procuram hospedeiros interiores
Quatro casas foram seleccionadas aleatoriamente em cada uma das aldeias do estudo e recrutadas após a obtenção do consentimento dos chefes de família. Em cada cabana, uma armadilha Mosclean ou uma armadilha com luz CDC foi colocada ao lado de uma cama dentro de um quarto onde um adulto dormiu voluntariamente debaixo da rede da cama. Como a cobertura das redes mosquiteiras tratadas com insecticida era > 90% nestas aldeias, realizámos o nosso estudo com estas redes em vez de redes não tratadas como as utilizadas nos testes de semi-campo. Com base no cronograma de atribuição de armadilhas, as cabanas 1, 2, 3 e 4 receberam cada uma um dos dois tipos de armadilhas. Nenhuma isca adicional foi adicionada às armadilhas. As armadilhas (1ª armadilha Mosclean, 2ª armadilha Mosclean, 1ª armadilha com luz CDC e 2ª armadilha com luz CDC) foram rodadas todas as noites entre cada uma das casas durante 12 noites, seguindo um desenho quadrado 4 × 4 Latino, replicado quatro vezes. Os testes duraram das 18:00 às 06:00 h de cada noite. Tanto as armadilhas luminosas Mosclean e CDC foram suspensas 150 cm acima do solo, em direção aos pés dos adormecidos. Os mosquitos apanhados por cada armadilha todas as noites foram classificados por taxa, sexo e estado fisiológico, depois contados e registados.
- (ii)
Comparação do desempenho da armadilha Mosclean quando utilizada em interiores e exteriores
Em estudos que medem o risco de morder o vector da malária, é comum avaliar as proporções de mordeduras que ocorrem em interiores versus proporções que ocorrem no exterior, de modo a determinar onde o risco de morder é maior e também se intervenções como os MTI e o IRS estão a abordar todo o espectro de exposição. Infelizmente, apesar das inovações recentes, como as armadilhas de rede elétrica e as armadilhas de rede dupla esperadas por humanos, não existem sistemas de armadilhagem apropriados além dos HLCs que avaliam essas proporções de forma consistente e precisa. A armadilha Mosclean foi, portanto, avaliada para determinar se ela seria adequada para coletas tanto em ambientes internos quanto externos. Quatro famílias foram seleccionadas aleatoriamente em cada aldeia e recrutadas após o consentimento do chefe de família. As armadilhas Mosclean foram então colocadas dentro ou fora de cada uma das casas. Quando usadas dentro de casa, a armadilha era colocada ao lado de uma rede de cama ocupada. Contudo, quando ao ar livre, a armadilha era colocada a aproximadamente 5 m da casa, mas ao lado de um adulto voluntário sentado debaixo de uma rede mosquiteira. A armadilha Mosclean ao ar livre foi colocada a 5 m da casa, com o objetivo de capturar mosquitos voando perto das habitações humanas. As armadilhas estavam a 150 cm acima do solo, tanto dentro como fora de casa. A cada manhã os mosquitos capturados dentro e fora de casa eram classificados por taxa, sexo e estado fisiológico, e os números registrados e comparados.
- (iii)
Testes para comparar as eficácias de campo das armadilhas Mosclean, BG-Sentinel e Suna ao ar livre
Estas experiências foram conduzidas ao ar livre usando um quadrado de 4 × 4 latinos, no qual os locais das armadilhas foram atribuídos aleatoriamente no início de cada ronda de quatro noites de amostragem. Foram utilizadas duas variantes de armadilha Mosclean, uma complementada com gás CO2 proveniente da fermentação de melaço de levedura e outra sem CO2 adicional. Quatro locais foram identificados em cada um dos dois vilarejos, separados por aproximadamente 100 m. Os quatro tipos de armadilha, armadilha Mosclean padrão sem isca adicional, armadilha Mosclean com CO2, armadilha Suna com CO2 e armadilha BG-Sentinel com CO2, foram rodados durante a noite entre os quatro locais ao ar livre durante quatro ciclos noturnos. A cada manhã, os mosquitos capturados por cada armadilha eram classificados por taxa, sexo e estado fisiológico, e os números registrados e comparados. Os testes foram realizados na estação seca de junho de 2017 a fevereiro de 2018.
- (iv)
Avaliando proporções de parous e proporções de fêmeas inseminadas de mosquitos Anopheles em armadilhas Mosclean e armadilhas com luz CDC
Mosquitos foram amostrados em quatro casas diferentes de uma aldeia durante 20 noites. Todos os mosquitos fêmeas An. arabiensis coletados foram dissecados. Uma armadilha semelhante foi feita por armadilhas com luz CDC e os mosquitos dissecados sob microscópios de luz estéreo para que as taxas de paridade e inseminação pudessem ser comparadas.
Os ovários ou espermatoses dissecados foram observados com uma ampliação de 10x sob um microscópio composto. O estado de paridade foi confirmado pela presença de traqueias traqueolares esticadas (fêmeas parosas) ou meadas traqueolares enroladas (fêmeas nulíparas), conforme detalhado . A inseminação foi confirmada pela observação se as espermathecas foram preenchidas ou não .
Análise de dados
Dados foram analisados usando software estatístico de código aberto, R v.3.5.0 . A eficácia da armadilha Mosclean foi comparada com a das outras armadilhas através do ajuste de modos mistos lineares generalizados (GLMM) usando o pacote lme4 . O número de mosquitos de diferentes espécies foi modelado seguindo distribuições binomiais negativas, tendo como efeito principal o tipo de armadilha. Os dias experimentais e o ID da barraca foram incluídos como um termo aleatório para explicar variações inexplicáveis dentro de dias e barracas. Gráficos foram criados no pacote ggplot2 . Regressão logística foi usada para avaliar as taxas de paridade e inseminação entre a armadilha CDC-light e a armadilha Mosclean. Um teste de likelihood ratio foi usado para verificar o efeito do efeito aleatório.