Specimen Requirements and Procedure
ELISAs são realizados em placas de poliestireno, tipicamente em placas de 96 poços revestidas para unir proteína muito fortemente. Dependendo do tipo de ELISA, os testes requerem um anticorpo de detecção primário e/ou secundário, analito/antigénio, anticorpo/antigénio de revestimento, tampão, lavagem e substrato/cromogénio. O anticorpo de detecção primário é um anticorpo específico que se liga apenas à proteína de interesse, enquanto o anticorpo de detecção secundário é um segundo anticorpo conjugado a uma enzima que liga um anticorpo primário que não é conjugado a uma enzima.
Há quatro etapas gerais principais para completar um imunoensaio ELISA. Estes passos são:
-
Revestimento (com antígeno ou anticorpo)
-
Bloqueio (tipicamente com adição de albumina de soro bovino)
-
Detecção
-
Leitura final
Detecção é efectuada pela adição de um substrato que pode gerar uma cor. Existem muitos substratos disponíveis para utilização na detecção ELISA. No entanto, os mais utilizados são a peroxidase de rábano silvestre (HRP) e a fosfatase alcalina (ALP). O substrato para HRP é o peróxido de hidrogênio e resulta em uma mudança de cor azul. A ALP mede a cor amarela do nitrofenol após períodos de incubação à temperatura ambiente de 15 a 30 minutos e normalmente usa P-Nitrofenil-fosfato (pNPP) como substrato.
Entre cada um dos quatro passos acima é uma “lavagem” da placa usando um tampão, como o tampão fosfato salino (PBS) e um detergente não-iônico, para remover o material não ligado. Os poços são lavados duas ou mais vezes durante cada etapa de lavagem, dependendo do protocolo específico a ser seguido.
No protocolo ELISA, normalmente, uma diluição em série das concentrações é colocada nos poços da placa. Após os resultados serem medidos, uma curva padrão dos dados das diluições em série é plotada com uma concentração no eixo x usando uma escala de log e absorvância no eixo y usando uma escala linear.
Existem quatro tipos principais de ELISA:
-
Elisa directo (placa revestida de antigénio; anticorpo de rastreio)
-
Elisa indirecto (placa revestida de antigénio; antigénio/anticorpo de rastreio)Elisa em forma de sanduíche (placa revestida de anti-corpo; antigénio de rastreio)Elisa competitivo (anticorpo de rastreio)
Elisa directo
Alguns ELISA directos e indirectos começam com o revestimento do antigénio às placas ELISA. O primeiro passo de ligação envolve a adição de antígeno às placas, que é incubado durante uma hora a 37 graus C ou pode ser incubado a 4 graus C durante a noite. Uma vez concluída a etapa de incubação, a etapa seguinte é lavar as placas de qualquer anticorpo potencial não ligado e bloquear quaisquer locais não ligados na placa ELISA utilizando agentes como BSA, ovalbumina, aprotinina, ou outras proteínas animais. Este segundo passo é importante porque evita a ligação de qualquer anticorpo não específico à placa e minimiza resultados falso-positivos. Após adicionar o tampão, a placa é lavada de novo, e é adicionado um anticorpo de detecção primário conjugado com enzimas seleccionado. A placa é ainda incubada durante uma hora.
Num ELISA directo, o anticorpo de detecção primário liga-se directamente à proteína de interesse. Em seguida, a placa é lavada de novo para remover qualquer anticorpo não ligado e seguida pela adição de um substrato/cromóforo, como a fosfatase alcalina (AP) ou a peroxidase de rábano (HRP) à placa, o que resulta numa mudança de cor. A mudança de cor da amostra ocorre ou pela hidrólise dos grupos fosfato do substrato por AP ou pela oxidação dos substratos por HRP. As vantagens do uso do ELISA direto incluem a eliminação da reatividade cruzada de anticorpos secundários, e devido a menos etapas, é rápido em comparação com o ELISA indireto. Suas desvantagens incluem sua baixa sensibilidade em comparação com os outros tipos de ELISA e seu alto custo de reação.
ELISA indireto
As etapas do ELISA indireto são idênticas ao ELISA direto, exceto por uma etapa de lavagem adicional e os tipos de anticorpos adicionados após a remoção do tampão. O ELISA indirecto requer dois anticorpos, um anticorpo de detecção primário que se cola à proteína de interesse e um anticorpo secundário ligado a uma enzima complementar ao anticorpo primário. O anticorpo primário é adicionado primeiro, seguido por um passo de lavagem, e depois o anticorpo secundário conjugado à enzima é adicionado e incubado. Depois disso, os passos são os mesmos do ELISA directo, que inclui um passo de lavagem, a adição de substrato e a detecção de uma mudança de cor.
O ELISA indirecto tem uma maior sensibilidade quando comparado com o ELISA directo. É também menos caro e mais flexível devido aos muitos anticorpos primários possíveis que podem ser utilizados. A única grande desvantagem deste tipo de ELISA é o risco de reactividade cruzada entre os anticorpos de detecção secundários.
Sandwich ELISA
Não semelhante ao ELISA directo e indirecto, o ELISA em sanduíche começa com um anticorpo de captura revestido nos poços da placa. É denominado “sanduíche” porque os antigénios são colocados entre duas camadas de anticorpos (anticorpos de captura e detecção). Depois de adicionar o anticorpo de captura às placas, as placas são então cobertas e incubadas durante a noite a 4°C. Uma vez concluída a etapa de revestimento, as placas são lavadas com PBS e depois tamponadas/bloqueadas com BSA. As lavagens do tampão são efectuadas durante, pelo menos, 1-2 horas à temperatura ambiente. Finalmente, a placa é lavada novamente com PBS antes da adição do antigénio.
O antigénio de interesse é então adicionado às placas para ligar ao anticorpo de captura e incubado durante 90 minutos a 37 graus C. A placa é lavada novamente e o anticorpo de detecção primário é então adicionado à placa e incubado durante mais 1 a 2 horas à temperatura ambiente, seguido de uma lavagem tampão. Em seguida, o anticorpo secundário conjugado com enzimas é adicionado e incubado durante mais 1 a 2 horas. A placa é lavada de novo e o substrato é adicionado para produzir uma mudança de cor. O ELISA sanduíche tem a maior sensibilidade entre todos os tipos de ELISA. As principais desvantagens deste tipo de ELISA são o tempo e a despesa e o uso necessário do “par combinado” (antigénio divalente/multivalente) e anticorpos secundários.
ELISA competitivo
Os testes ELISA competitivos para a presença de um anticorpo específico para antigénios no soro de teste. Este tipo de ELISA utiliza dois anticorpos específicos, um anticorpo conjugado a uma enzima e outro anticorpo presente no soro teste (se o soro for positivo). A combinação dos dois anticorpos nos poços permitirá uma competição pela ligação ao antígeno. A presença de uma mudança de cor significa que o teste é negativo porque o anticorpo conjugado com enzimas ligou os antígenos (não os anticorpos do soro de teste). A ausência de cor indica um teste positivo e a presença de anticorpos no soro de teste. O ELISA competitivo tem uma baixa especificidade e não pode ser usado em amostras diluídas. No entanto, os benefícios são que há menos purificação da amostra necessária, pode medir uma grande variedade de antigénios numa determinada amostra, pode ser usado para antigénios pequenos e tem uma variabilidade baixa.