Como o zebrafish diminutivo está tendo um grande impacto na pesquisa médica

Começa com sexo na praia. Pares de zebrafish separados do resto do cardume e se movem em águas mais rasas e rasas, continuando a cavar ao redor um do outro em movimentos rápidos de dardo. Quando a fêmea chega ao solo que está apenas alguns centímetros abaixo da linha de água, uma resposta biológica é desencadeada pela sua proximidade da costa e ela põe uma ninhada de várias centenas de ovos. Estes são prontamente fertilizados pelo seu parceiro. Em poucos dias, centenas de jovens zebrafish desenvolveram-se até um estágio onde podem caçar e comer presas.

É uma performance notável, um dos rituais de reprodução mais intrigantes da natureza (ver caixa, página 32). Mas o acasalamento do zebrafish tem implicações que vão muito além da mera curiosidade biológica. Este é um peixe que adquiriu uma importância científica surpreendente nos últimos anos e que está agora a desempenhar um papel fundamental na desvendação dos papéis de todos os 20.000 genes dentro do corpo humano. Uma criatura mais conhecida como animal de aquário tornou-se uma estrela científica.

É uma transformação dramática. Mas porque ocorreu? O que há de tão especial neste pequeno denizen a preto e branco de correntes de água doce asiáticas. E, mais importante, quais são os segredos médicos que ela está ajudando a desvendar? A resposta à primeira pergunta é simples. A crescente popularidade do zebrafish surgiu porque ele faz tic-tac em quase todas as caixas de uma lista de atributos que os cientistas procuram quando tentam modelar doenças humanas.

Para começar, há a simples questão dos números. Cada vez que um zebrafish põe seus ovos, ela produz centenas de descendentes, fornecendo aos cientistas um amplo suprimento de alvos para suas pesquisas. Além disso, o zebrafish cresce a um ritmo espantoso. “Um embrião desenvolver-se-á tanto num dia como um embrião humano num mês e um peixe atingirá a idade adulta – e o seu tamanho máximo de cerca de dois centímetros – dentro de três meses”, diz a investigadora do zebrafish, Elisabeth Busch-Nentwich, no Instituto Sanger em Cambridgeshire.

Para uma boa medida, é fácil manter grandes números de zebrafish em laboratórios. Uma dieta de camarões em salmoura e água doce irá mantê-los felizes durante anos. E finalmente, e provavelmente o mais importante, os zebrafish jovens são quase completamente transparentes, uma característica crítica para ele permite que os pesquisadores estudem células dentro de seus corpos enquanto crescem e se dividem. Este último ponto é enfatizado por outra pesquisadora Sanger, Keren Carss. “Você pode fazer todo tipo de mudanças experimentais em embriões de zebrafish e ver os resultados fisiológicos quase imediatamente”. E você pode estudar essas mudanças muito facilmente por causa da quase transparência do zebrafish. Você pode ver o que está acontecendo sem tocá-los e isso não é algo que você possa fazer com outros animais de laboratório, que têm que ser mortos para serem estudados. Isso torna o zebrafish muito útil à ciência”

Na verdade, Danio rerio, para lhes dar o seu nome científico, não são tão úteis para a investigação biológica moderna como indispensáveis. Em combinação com sua transparência e sua notável taxa de crescimento, a estrutura genética do zebrafish é surpreendentemente próxima à do Homo sapiens.

Como resultado, os cientistas já usaram os peixes para identificar as funções de centenas de genes humanos. “Graças à conclusão do Projeto Genoma Humano há 10 anos, descobrimos as estruturas de todos os cerca de 20.000 genes que compõem a constituição humana”, diz Derek Stemple, chefe da genética do rato e do zebrafish no Sanger.

“Mas não aprendemos o que estes genes fazem dentro do corpo humano. Essa é a tarefa que enfrentamos hoje. Precisamos descobrir o que nossos genes fazem, que proteínas eles fazem, e como interagem. Aprendemos o que alguns genes fazem, mas os papéis da grande maioria permanecem um mistério – e é aí que entra o zebrafish.

“Cerca de 70% dos nossos genes acabam por ter um homólogo zebrafish. Mais ao ponto, se você olhar para os genes que causam doenças em humanos, 84% destes têm análogos de zebrafish. É por isso que o Wellcome Trust pagou tanto dinheiro para estudar o zebrafish no Sanger Institute”

Sucessos alcançados ao comparar genomas humanos e zebrafish incluem descobertas de vários genes anteriormente desconhecidos que estão envolvidos em raras formas de distrofia muscular; de vias genéticas envolvidas no desenvolvimento do embrião humano e na fisiologia cardíaca; e medicamentos que estão agora a ser testados como futuros tratamentos para o cancro da pele. O trabalho do Dr. Tim Chico, cardiologista consultor da Universidade de Sheffield, fornece outro exemplo. “Os mesmos caminhos e genes que fizeram meu coração e seu coração são responsáveis por ligar o desenvolvimento do coração em zebrafish”, aponta Chico. E essa semelhança tem implicações muito importantes, ele acrescenta.

“Temos uma biblioteca de muitos milhares de compostos que podem ser o próximo melhor medicamento para doenças cardíacas”. Com o zebrafish, podemos rapidamente examiná-los para ver se os compostos têm um efeito. Podemos desligar os genes e ver como o zebrafish rebrota vasos para reparar os danos. Se pudéssemos ligar os genes certos em humanos, então poderíamos viver mais tempo e sobreviver melhor após um ataque cardíaco”

Estes projetos explicam porque o zebrafish se tornou um animal tão “pin-up” para os cientistas. Mas exatamente como os pesquisadores transformam a informação de uma criatura que compartilhou pela última vez um ancestral comum com a humanidade há cerca de 300m atrás? A resposta é fornecida pela Stemple. O pesquisador está sentado em um escritório cheio de bicicletas, capacetes de choque e vários itens de roupas descartadas. O seu quarto tem vista para um vasto canteiro de obras na extremidade do Campus de Genoma de Cambridgeshire, onde está a ser construído um novo centro para o Instituto Europeu de Bioinformática, que partilha o local com o Instituto Sanger. Desenvolvido pela primeira vez no século passado, o Genome Campus tem sido o foco de intensa expansão desde então, impulsionado pelo notável boom na tecnologia genética.

Os cientistas levaram anos, e gastaram bilhões de libras, para sequenciar o primeiro genoma humano. Hoje, essa tarefa pode ser feita por alguns milhares de libras e leva apenas algumas horas. Trilhões de bits de dados são agora despejados diariamente a partir dos sequenciadores genéticos automatizados do Instituto Sanger, à medida que os seus investigadores sondam as estruturas genéticas de pacientes, animais – incluindo o zebrafish – e células tumorais, uma avalanche de dados que é controlada a partir de um conjunto de computadores poderosos que têm o seu próprio edifício, impressionantemente grande. “A bioinformática é a ciência do futuro”, diz Stemple. “Ela conduz o nosso trabalho aqui e conduz a nossa pesquisa sobre o zebrafish.”

Ser capaz de analisar vastos pedaços de dados é importante no uso do zebrafish para provocar os segredos dos genes humanos. Os procedimentos subjacentes utilizados para gerar esta informação são baseados em abordagens mais tradicionais da investigação genética. “O que fazemos é gerar mutações”, diz Stemple. “Tratamos o zebrafish macho com químicos e isso cria mutações nos seus genes.”

Os genes são responsáveis por dirigir a fabricação de proteínas nos corpos de todos os animais. Portanto, uma mutação num gene irá perturbar a proteína que ele faz. Por exemplo, ela pode fabricar uma proteína que é cortada ao meio. O truque dos pesquisadores é ligar uma mutação específica em um gene com uma mudança na aparência ou comportamento do zebrafish, uma conexão que os levará a descobrir a proteína que normalmente é feita por esse gene.

“Nosso objetivo é descobrir a função de um gene quando ele não foi mutado, quando ele está em seu estado normal”, acrescenta Busch-Nentwich. “Porque o zebrafish tem tantos equivalentes próximos aos genes do Homo sapiens que também nos dirão a função do gene humano”.

Para fazer isso, os pesquisadores – uma vez criados os seus machos zebrafish mutantes – os reproduzem com zebrafish fêmeas normais e não tratadas. As mutações dos machos são então passadas para uma nova geração de zebrafish. Esta primeira geração de peixes é então cruzada para criar uma segunda geração na qual alguns peixes possuem duas cópias do mesmo gene mutado – uma da mãe, outra do pai – e que se manifestará claramente na fisiologia dos peixes jovens.

“Nós também sequenciamos os genomas dos peixes que estamos a reproduzir”, acrescenta Stemple. “Depois olhamos para os peixes da nossa geração final e examinamos aqueles com características incomuns”. Por exemplo, recentemente encontramos uma família de zebrafish, criada através de nossa pesquisa de mutação, que não tinha pigmentação.

“Também pudemos ver pela nossa análise do genoma que possuía uma mutação em um gene chamado slc22a7b. Havia uma ligação clara indicando que este gene está envolvido na pigmentação. Mais ao ponto, existe um equivalente humano a esse gene que agora acreditamos ser responsável pela codificação de genes que estão envolvidos na pigmentação em humanos”

Um outro exemplo do valor do zebrafish para a medicina é fornecido pela pesquisa realizada por Carss at the Sanger. Ela trabalha em uma forma de distrofia muscular conhecida como distroglicopatia, que é geralmente encontrada em bebês e crianças pequenas e causa fraqueza e perda de movimento. Usando zebrafish, Carss descobriu que mutações nos genes B3galnt2 e GmppB produziram embriões que eram pequenos e dobrados em comparação com embriões saudáveis.

“Os embriões zebrafish com os genes perturbados têm defeitos estruturais e funcionais que imitam os sintomas de crianças com distroglicopatia”, acrescenta Carss. “É uma evidência muito forte que as mutações que encontramos em B3galnt2 e GmppB causam distroglicopatia em crianças”. Saber que esses genes estão envolvidos nos dá pistas sobre os tratamentos que podemos ser capazes de dar a essas crianças. Para uma boa medida, embriões de zebrafish poderiam ser usados para testar esses tratamentos”

Entusiasmo pela pesquisa com zebrafish também é compartilhado por Leonard Zon, professor de medicina pediátrica, no Boston Children’s Hospital, parte da Escola de Medicina de Harvard. “O zebrafish é um sistema biológico fantástico”, diz ele. “Os seus embriões podem absorver químicos que você adicionou à sua água. Por isso é fácil induzir mutações nos seus genes”

Num conjunto de experiências realizadas pela sua equipa, Zon adicionou vários medicamentos aos embriões de zebrafish e descobriu um, chamado prostaglandina E2, que aumentou os seus níveis de células estaminais sanguíneas – e por inferência os níveis de células estaminais sanguíneas em humanos. Estas células, que são feitas na nossa medula óssea, são os precursores de todos os tipos de células que compõem o nosso sangue, incluindo as células brancas que formam o nosso sistema imunitário.

A descoberta pode ser significativa, diz Zon, porque pode ser utilizada para melhorar os transplantes de células estaminais para pacientes, em particular aqueles que sofrem de cancros. “A medula óssea é destruída durante a quimioterapia e tem de ser substituída nos pacientes assim que o seu tratamento estiver terminado”. Se um paciente não tiver um familiar cuja medula óssea coincida com a sua, um médico utilizará células estaminais sanguíneas retiradas de cordões umbilicais. Hoje em dia estas são armazenadas rotineiramente em bancos de cordão umbilical. As transfusões de sangue do cordão umbilical podem restaurar o sistema imunitário do paciente. No entanto, estes cordões contêm apenas algumas células e precisamos de encontrar formas de aumentar rapidamente o número de células estaminais do sangue enquanto os pacientes estão imunes. A prostaglandina E2 – que identificámos no nosso trabalho com o zebrafish – sugere uma forma de o fazermos”

Esta ideia já foi apoiada por experiências iniciais com zebrafish e ratos. Zon e sua equipe retiraram medula óssea de ratos e trataram alguns com prostaglandina. Alguns foram deixados sem tratamento. Então os cientistas devolveram a medula óssea aos ratos. A medula tratada com prostaglandina restaurou o sangue e o sistema imunológico do rato muito mais rapidamente do que a versão não tratada.

Este trabalho com animais foi agora repetido num ensaio clínico de fase um em humanos, acrescentou Zon. Em pacientes com leucemia que tinham sido submetidos a quimioterapia, verificou-se que as transfusões de sangue do cordão umbilical que foram tratadas com prostaglandina restauravam os glóbulos brancos e plaquetas vários dias antes, em comparação com pacientes que não tinham prostaglandina adicionada às suas transfusões de sangue do cordão umbilical. “É um desenvolvimento muito promissor”, acrescenta Zon.

O Instituto Sanger tem fundos para estudar 8.000 conjuntos de zebrafish mutante cruzado dos quais seus cientistas esperam identificar a função de 80-90% de todos os genes humanos.

“Até agora, nós sequenciamos os genomas de cerca de 3.000 zebrafish mutante e identificamos mutações em cerca de metade de todos os genes codificadores de proteínas”, diz Stemple. Tornamos toda esta informação publicamente disponível através de centros como o Zebrafish International Resource Centre, no Oregon, e o European Zebrafish Resource Centre, em Karlsruhe, na Alemanha. Também enviamos amostras de esperma congelado de cada uma das estirpes mutantes de zebrafish que criámos para estes centros, para que possam ser arquivadas lá. Os cientistas de qualquer parte do mundo podem então pedir para usar este esperma congelado para criar uma estirpe de zebrafish com uma mutação particular. Os medicamentos que podem tratar doenças ligadas ao equivalente humano deste gene podem então ser testados para encontrar o mais eficaz.

“Estamos desenvolvendo uma ferramenta enormemente poderosa desta forma, uma que irá identificar as funções de todos os nossos genes e nos ajudará a criar novos medicamentos que podem combater doenças ligadas a esses genes. E tudo isso está acontecendo graças ao zebrafish.”