Conversão do mRNA em cDNA de dupla corda

Conversão enzimática do mRNA em ADN de dupla corda inserido pode ser realizada por uma série de procedimentos diferentes. Todos eles envolvem a ação da transcriptase reversa e da síntese de cDNA com oligonucleotídeos. Depois disso, os procedimentos em uso comum divergem consideravelmente. Há uma série de métodos para sintetizar a segunda vertente e vários procedimentos para produzir fins adequados para a produção de DNA clonável. Os principais objetivos desses procedimentos são construir um DNA inserido o mais longo possível, com um alto rendimento de conversão de mRNA em DNA que pode se ligar ao DNA vetorial. Os seguintes protocolos requerem apenas reagentes disponíveis comercialmente e normalmente são bem sucedidos na produção de boas bibliotecas de cDNA. O protocolo básico descreve um método para a produção de cDNA em blunt-end que pode então ser ligado a ligadores para posterior clonagem em um local de restrição único, como o EcoRI. O Protocolo Alternativo é uma variação que requer menos manipulações enzimáticas e permite a construção de bibliotecas direcionais de cDNA, que são particularmente desejáveis quando o objetivo é gerar bibliotecas de expressão de cDNA. O Protocolo Alternativo tira vantagem de um linker-primer que consiste de (na ordem de 3′ a 5′) um iniciador oligo(dT), um site de restrição para o endonuclease XhoI, e uma repetição (GA)20 para proteger o site de restrição durante a geração do cDNA com extremidade embotada. Os locais internos de XhoI nas moléculas individuais de cDNA são protegidos pela incorporação de 5-metil-dCTP na mistura de nucleotídeos de primeira linha. Os cDNAs resultantes com pontas únicas podem ser clonados em vetores EcoRI /XhoI após a ligação de adaptadores EcoRI à ponta de 5′ e digestão pelo XhoI para liberar os locais de 3′ XhoI que foram incorporados ao cDNA pelo linker-primer. Estas alterações resultam num procedimento consideravelmente simplificado que é substancialmente mais rápido e fácil do que o protocolo básico.