Cromatografia de coluna e TLC

Escrito por Lyudamila

Introdução:

O método usado para purificação de compostos químicos ou estabelecer quantos compostos diferentes uma mistura carrega ou determinar a polaridade de uma mistura química é amplamente conhecido como cromatografia. O princípio básico da cromatografia é separar certos compostos com base na sua estrutura, capacidade de ligação ao hidrogênio e polaridade entre a fase estacionária e a fase móvel. Existem diferentes tipos de dispositivos cromatográficos utilizados e várias técnicas de separação que são aplicadas para separar misturas químicas. Aqui, apresentamos dados do uso da Cromatografia em Coluna e Cromatografia de Camada Fina para separar o fluoreno da 9-fluoreneona e para determinar a melhor mistura de solvente para uma separação.

Tabela de constantes físicas:

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Nome químico	Fórmula química	MW: (g/mol)	Ponto de Enchimento (°C)	Ponto de Fusão (°C)	Índice de Refracção (nD)
Hexano	C6H14	86.18	69		1.375
Dióxido de silício	SiO2	60.1		1600-1725	–
Fluorene	C13H10	166.22	295		–
9-Fluorenona	C13H8O	180.19	342		1.6309
Acetone	C3H6O	58.08	57		1.35900

Materiais & Métodos:

Cromatografia de coluna:

Para embalar a coluna, sílica gel foi misturada com 14mL de um solvente não polar, hexano e transferida para dentro da coluna. 1mm de areia foi entregue à coluna para que ela ficasse no topo do leito de sílica gel. Para carregar a coluna, cerca de .3mL da mistura de flúor e 9-fluorenona foi entregue, o que era visível por uma faixa amarela. Em seguida, 4 eluições foram coletadas em tubos de ensaio, pois o hexano estava sendo continuamente adicionado à coluna. O sistema solvente foi alterado para uma mistura de hexano e acetona (70:30) e as frações da mistura foram coletadas em tubos de ensaio separados até que a faixa amarela fosse eluída da coluna.

Cromatografia de camada fina:

As 4 eluições do sistema solvente somente para hexano foram coletadas e concentradas até aproximadamente 1/4 do volume original e as frações da mistura do sistema solvente para hexano e acetona foram coletadas e concentradas em ½ do volume original. Uma amostra (amostra #1) das eluições de hexano e uma amostra (amostra #2) das frações de hexano-acetona foram marcadas separadamente uma da outra através de um tubo microcapilar sobre a camada fina ou adsorvente revestido na placa TLC. Uma terceira amostra da mistura original (amostra #3) que foi carregada no topo da coluna também foi marcada na placa TLC. O solvente TLC foi utilizado para mergulhar na placa de TLC para permitir que substâncias não polares se movessem mais rapidamente para cima da placa e para permitir que substâncias polares se movessem para cima da placa a um ritmo mais lento ou nem sequer o fizessem. A placa de TLC foi removida assim que o solvente subiu a placa até 1cm do topo. O fator de retenção foi então calculado.

Resultados:

Os sistemas de solvente separaram fluoreno e 9-fluorenona com base em sua diferença de estrutura e polaridade. O sistema de solvente hexano foi útil na lavagem de qualquer coisa que fosse hidrofóbica por ser não-polar, e essencialmente lavou a maior parte do fluoreno, já que o fluoreno não é tão polar como a 9-fluorenona. O sistema de solvente com uma mistura entre acetona e hexano permitiu que a faixa amarela fosse eluída da coluna porque solventes polares como a acetona são úteis para mover compostos químicos pela coluna que tendem a ter uma polaridade maior, como a 9-fluorenona.

Estruturalmente, o fluorene não tem um grupo funcional carbonilo e a 9-fluorenona tem. Para esta diferença, o oxigênio que se mantém fora da 9-fluorenona foi capaz de se ligar hidrogênio às contas de sílica gel, o que permitiu que ela fosse mantida mais apertada na coluna do que o fluoreno. Como a 9-fluorenona foi mantida mais apertada nas contas de sílica gel na coluna, ela não desceu na coluna tão rapidamente quanto o fluoreno. Em princípio, o composto químico que flui através da coluna a uma velocidade mais rápida é mais não-polar; portanto, neste caso, o fluoreno era mais não-polar que a 9-fluorenona.

Os fatores de retenção foram calculados para encontrar as distâncias que as amostras dos compostos a serem testados subiram na placa em relação às distâncias movimentadas pela frente do solvente. A placa mostrou que o fluorene subiu a placa a um nível superior a 9-fluorenona. O Rf=.8cm para fluorene e .67cm para 9-fluorenona. O fluorene era visível apenas sob luz UV porque é um composto incolor, ao contrário da 9-fluorenona que é amarela. Era difícil medir com precisão o Rf para a mistura original que mantinha a combinação dos dois compostos químicos, mas visivelmente, havia uma marca amarela na placa de TLC que era paralela à marca amarela de 9-fluorenona da amostra 2, e havia uma marca incolor na placa de TLC que era visível sob luz UV que estava em torno da mesma área de comprimento do fluorene da amostra 1.

Discussão:

Analizando o quanto os dois compostos foram atraídos para a fase estacionária do sílica-gel na coluna, podemos entender porque os compostos se moveram para baixo da coluna na velocidade que eles fizeram. A separação dos compostos resultou da sua diferença nas taxas de migração que foram afetadas pela diferença na estrutura e polaridade dos compostos. Na cromatografia em coluna, os compostos não polares movem-se para baixo da coluna a uma taxa mais rápida do que os compostos polares, mas ao realizar um protocolo TLC, podemos ver que as moléculas não polares movem-se para cima da placa mais rapidamente do que os compostos polares que se movem para cima da placa a uma taxa mais lenta ou não se movem para cima.
Overall, a minha placa TLC poderia ter mostrado melhores resultados se o comprimento do meu gel de sílica tivesse sido superior a 4cm. Se eu tivesse feito o procedimento de uma maneira melhor, a separação entre os dois compostos teria sido mais pura e meus fatores de retenção teriam mudado.