Resultados e discussão
O ensaio ‘autophagic flux’ descrito em Jiang et al. é um ensaio quantitativo de reportagem da proteína fluorescente verde (GFP) que mede as alterações ratiométricas da poliQ-GFP para libertar a GFP através da análise Western blot. A construção de um repórter multicistrônico foi projetada para codificar duas proteínas; poliQ ligada à GFP N-terminal e GFP livre. A sequência viral 2A (v2A) foi colocada como uma região de ligação entre as sequências de codificação das duas proteínas para permitir a tradução estequiométrica de duas proteínas separadas de um quadro de leitura aberto (Fig. 1a) .
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Gerar as construções putativas Q52, Q31 e Q10-GFP usando a construção do Tol2-Q80-GFP-v2A-GFP multi-distrônico. a Mapa vetorial da construção do Tol2-Q80-GFP-v2A-GFP. b Resumo do uso de códão degenerado CAA e CAG nesta construção. c Cromatógrafo da construção representando os trigêmeos CAG e CAA com codificação de glutamina espaçados aleatoriamente. d Ilustração esquemática da amplificação da exclusão baseada em PCR do Q80-GFP contendo a construção para gerar construções poli-Q com menor número de repetições de glutamina. e Sequência Q80 mostrando os sítios de ligação de primers Q52, Q31 e Q10. f Sequências de primers destinados a gerar construções Q52, Q31 e Q10. g Electroforese em gel de agarose analítica para cada um dos supostos vectores Q80, Q52, Q31 e Q10 usando primers que flanqueiam a região do poliQ. Os tamanhos dos produtos PCR de ~ 270, ~ 180, ~ 120 e ~ 60 bp para os supostos Q80, Q52, Q31 e Q10-GFP construídos, respectivamente, foram vistos
Concebemos uma sequência de poli-Q contendo 80 repetições de glutamina (Q80). A sequência foi desenhada para ter baixa semelhança de repetição através do espaçamento aleatório entre trigêmeos CAG codificadores de glutamina com trigêmeos CAG codificadores de glutamina (Fig. 1b, c). As substituições dos nucleotídeos foram feitas por olho para gerar um padrão semi-aleatório. Este desenho de sequência não repetitiva deve não só aumentar a estabilidade da sequência durante a propagação em bactérias, mas também permitir o desenho de primers PCR que se recozem para regiões específicas da sequência.
PolyQ construções com menor número de repetições de glutamina foram geradas pela amplificação de exclusão baseada em PCR da construção Tol2-Q80-GFP-v2A-GFP. Os iniciadores foram desenhados para amplificar em torno do vector excluindo um número definido de repetições de glutamina para gerar as construções de interesse (Fig. 1d-f). O objectivo era gerar vectores com aproximadamente 52 (Q52), 31 (Q31) e 10 (Q10) repetições de glutamina. Os supostos vetores Q52 e Q31 foram gerados usando o mesmo primer reverso acoplado a diferentes primers para frente. Este iniciador reverso comum amplificou 2 repetições de glutamina, enquanto os iniciadores avançados amplificaram as repetições adicionais de 50 e 29 glutaminas necessárias para gerar os vetores Q52 e Q31, respectivamente. A posição do iniciador invertido foi ligeiramente deslocada para optimizar a amplificação do suposto vector Q10, de modo a que o iniciador invertido amplificasse agora 5 repetições de glutamina enquanto o iniciador frontal amplificava as restantes 5 repetições de glutamina (Fig. 1d-f). Usando temperaturas de recozimento rigorosas na reacção PCR, obtivemos ligação específica do primer. O gel extraído e os produtos de PCR purificados foram fosforilados, circularizados por auto-ligação e subsequentemente transformados em células competentes (ver Ficheiro adicional 3). A PCR usando primers que flanquearam a região polyQ mostrou aproximadamente os tamanhos de produto esperados para os supostos vectores Q52, Q31 e Q10 (Fig. 1g). As construções geradas foram sequenciadas para determinar se os números esperados de repetição do poliQ estavam presentes. Enquanto a construção Q52 tinha o número esperado de repetições de glutamina (Fig. 2a, b), a sequência revelou pequenas discrepâncias com os números esperados de poli-Q para as outras duas construções, onde o vector Tol2-Q31-GFP-v2A-GFP tinha 21 repetições de glutamina (doravante referido como Tol2-Q21-GFP-v2A-GFP) (Fig. 1g). 2c, d) e o vector Tol2-Q10-GFP-v2A-GFP tinha repetições de 11-glutamina (a seguir referido como Tol2-Q11-GFP-v2A-GFP) (Fig. 2e, f). Uma análise mais detalhada revelou que a sequência Q21 gerada foi derivada directamente da sequência original e a perda de repetições de glutamina foi devida à ligação Q31 a 30 bp a jusante do local de ligação previsto. Em contraste, a repetição adicional de glutamina na seqüência Q11 foi gerada de novo, uma adição de um códon CAA.
Mapa vectorial e análise da sequência de construção para Q52, Q21 e Q11-GFP gerada por amplificação de excisão baseada em PCR. a Mapa vectorial da construção Tol2-Q52-GFP-v2A-GFP. b Cromatógrafo da construção Q52. c Mapa vetorial da construção de Tol2-Q21-GFP-v2A-GFP. d Cromatógrafo da construção Q21. e Mapa vetorial da construção de Tol2-Q11-GFP-v2A-GFP. f Cromatógrafo do Q11 construct
Para estudar a cinética de agregação e o ‘fluxo autofágico’ da proteína polyQ in vivo, injetamos os vetores polyQ gerados (25 ng/μL) e transpomos mRNA (25 ng/μL) em grupos de embriões de zebra em um estágio (Fig. 3a, b). Para cada grupo foi realizada uma análise de Western blot analysis com anticorpos anti-GFP de lisados de embriões 24 h após a fertilização (hpf) (10 embriões por amostra). O vector Tol2 vazio (25 ng/μL) e o mRNA transposto (25 ng/μL) de embriões injetados e não injetados foram incluídos como controles. Os embriões injetados com as construções de poliQ produziram duas bandas detectadas pelo anticorpo anti-GFP como esperado; GFP ligado ao poliQ (poliQ80-GFP a ~ 48 kDa, poliQ52-GFP a ~ 38 kDa, poliQ21-GFP a ~ 33 kDa e poliQ11-GFP a ~ 31 kDa), e GFP livre (~ 27 kDa) (Fig. 3c). Cada um dos poli-Q-GFP construídos expressando lisados embrionários também mostrou uma faixa mais fraca de tamanho proteico correspondente ao comprimento total do poli-QX-GFP-v2A-GFP construído (poli-Q80-GFP-v2A-GFP a ~ 75 kDa, poli-Q52-GFP-v2A-GFP a ~ 65 kDa, poli-Q21-GFP-v2A-GFP a ~ 60 kDa, e poli-Q11-GFP-v2A-GFP a ~ 58 kDa). Esta banda representa os ~ 10% do total da proteína que é traduzida como uma proteína única e completa quando se utiliza o sistema de sequência v2A . Os rácios Q80-GFP:GFP, Q52-GFP:GFP, Q21-GFP:GFP e Q11-GFP:GFP são ~ 5, ~ 4, ~ 2 e ~ 1, respectivamente (Fig. 3d). Como a sequência v2A permite a tradução estequiométrica das proteínas poliQ-GFP e GFP, em teoria a razão poliQ-GFP:GFP deve ser 1. Os maiores rácios observados podem indicar uma acumulação dessas proteínas. Estas observações estão de acordo com a literatura, onde foi demonstrado que as construções de fusão poliglutamínicas contendo mais de 19 resíduos de glutamina agregam dentro das células transfectadas de uma forma dependente do comprimento. Estas observações levam-nos a concluir que os nossos edifícios Tol2-QX-GFP-v2A-GFP fornecem uma ferramenta útil para estudar o “fluxo autofágico” in vivo num modelo larval de zebrafish.
Análise da expressão de construção Tol2-QX-GFP-v2A-GFP em D. rerio. Os embriões Zebrafish foram injetados com 25 ng/µL da construção Tol2-QX-GFP-v2A-GFP e 25 ng/µL de codificação mRNA para Tol2 transposase. imagens de campo brilhante (painéis superiores) e fluorescentes (painéis inferiores) da visão lateral esquerda da cabeça do embrião zebrafish e regiões do tronco expressando Q80, Q52, Q21 e Q11-GFP, ~ 24 hpf. b Imagens de campo brilhante (painéis superiores) e fluorescentes (painéis inferiores) da vista lateral esquerda do tronco embrionário de zebra e das regiões da cauda expressando Q80, Q52, Q21 e Q11-GFP, ~ 24 hpf. c Análise de Western blot da expressão das construções Qx-GFP em D. rerio. Foram isoladas proteínas de ~ 24 hpf embriões que expressam as construções Q80, Q52, Q21 e Q11-GFP. As proteínas foram resolvidas em um gel de SDS-PAGE 10% e transferidas para uma membrana de nitrocelulose. A membrana foi sondada com um anticorpo anti-GFP. O vetor Tol2 “vazio” possui um gene GFP expresso que é substituído durante a inserção da construção. d Quantificação de Western blot. A intensidade de GFP para cada banda numerada do Western blot e a relação Qx-GFP para GFP livre são apresentadas
Conclusão
Em conclusão este estudo fornece uma solução robusta e facilmente adotável para gerar comprimentos próximos aos pretendidos de repetições de poli-Q. A fim de gerar números exatos de repetições de glutamina, podem ser realizadas as subseqüentes rodadas de amplificações com sequências de primer alteradas. Além disso, o comprimento do primer pode ser aumentado para melhorar a especificidade do recozimento do primer para o modelo. Nossa técnica tem várias vantagens sobre os métodos existentes para amplificação de regiões repetitivas baseadas em PCR e visa minimizar a geração de produtos PCR não específicos e repetições defeituosas, explorando a redundância do códon do código genético para gerar uma sequência de codificação de DNA sinônimo com repetição reduzida. Além disso, nossa abordagem não se limita a gerar seqüências de repetição poli-Q, mas também pode ser generalizada para gerar outras seqüências de repetição de nucleotídeos. Além disso, nosso método é relativamente barato, pois apenas a construção inicial do poliQ80-GFP-v2A-GFP requer síntese comercial, cujo custo depende do preço por base de nucleotídeos, comprimento, pureza e massa. Todos os outros materiais necessários são reagentes padrão utilizados para a clonagem molecular. Em resumo, a técnica descrita fornece uma solução fácil de adotar e acessível para gerar seqüências de DNA com codificação repetida que podem ser manipuladas conforme necessário.