Detecção de endotoxina – do lisado de limulus amebocyte limulus ao fator recombinant C

A endotoxina bacteriana Gram negativa é um pirogênio biológico que causa febre quando introduzido por via intravenosa. A endotoxina, também conhecida como lipopolissacarídeo (LPS), é encontrada na membrana externa da bactéria Gram-negativa. Durante a sepsis Gram-negativa, a endotoxina estimula os macrófagos hospedeiros a liberar citocinas inflamatórias. No entanto, a inflamação excessiva causa falência de múltiplos órgãos e morte. As endotoxinas, que são moléculas patogénicas ubíquas, são uma desgraça para a indústria farmacêutica e para a comunidade de saúde. Assim, a detecção precoce e sensível da endotoxina é crucial para prevenir a endotoxemia. O lisado de limulus amebocyte (LAL) tem sido amplamente utilizado há ~30 anos para a detecção de endotoxina na garantia de qualidade de medicamentos injetáveis e dispositivos médicos. O LAL constitui uma cascata de proteases serinas que são despoletadas por níveis vestigiais de endotoxina, culminando num coágulo de gel no final da reacção. O Factor C, que normalmente existe como um zymogen, é o primer desta cascata de coagulação. In vivo, o Fator C é o biosensor perfeito, que alerta o caranguejo-ferradura da presença de um invasor Gram-negativo. O ponto final hemostático prende o invasor, matando-o e limitando a continuação da infecção. No entanto, como uma ferramenta de detecção de endotoxinas in vitro, variações na sensibilidade e especificidade da LAL à endotoxina, e a diminuição do fornecimento de caranguejos ferradura estão a colocar desafios crescentes à indústria biotecnológica. Isto tem exigido a inovação de um teste alternativo para endotoxina. Assim, o Factor C tornou-se o alvo óbvio, embora complicado, para o esforço tecnológico recombinante. Este capítulo documenta o remanso da mineração do lisado de sangue natural das espécies ameaçadas ao monumental esforço da engenharia genética, para produzir o Fator C recombinante (rFC). O rFC é uma molécula de 132 kDa, que foi produzida como uma proenzima induzível pela presença de níveis vestigiais de endotoxina. A rFC forma a base do kit “PyroGene”, que é um novo ensaio de diagnóstico de endotoxinas microenzimáticas para telas de endotoxina de alto rendimento. Usando o rFC, a Lonza Inc. desovou o “PyroSense”, que serve como ponto de verificação da linha de produção biotecnológica. Assim, da clonagem a aplicações comerciais, o rFC iniciou uma nova era nos testes de endotoxinas para a garantia de qualidade de produtos biomédicos e para a indústria da saúde, enquanto poupa os caranguejos ferradura ameaçados de extinção.