Elucidando o papel funcional de Mycobacterium smegmatis recX na resposta ao estresse

(A,B) Níveis relativos de expressão dos genes M. smegmatis mc2155 recA e recX nas fases inicial de log, médio-log e estacionário sob condições de crescimento aeróbico e hipóxico. (C) Níveis relativos de expressão dos genes sigH2 e sigH7 nas fases inicial de log, médio-log e estacionária. As intensidades de sinal foram determinadas conforme descrito na seção Métodos. Os histogramas representam os valores médios de três experimentos independentes. Os níveis de expressão foram determinados e normalizados para 16S de expressão do RNA ribossômico e razões de indução calculadas em relação à quantidade de transcrição na cultura aeróbia da fase logarítmica inicial. As barras de erro representam o erro padrão da média calculada a partir de 3 réplicas independentes.

No entanto, deve-se notar que os níveis de mRNA não podem ser usados como substitutos para os níveis de proteína correspondentes. Portanto, a abundância de proteínas RecA e RecX em M. smegmatis foi medida em condições aeróbicas e hipóxicas por um ensaio Western blot usando anticorpos anti-RecA e anti-RecX. GroEL foi sondado como um controle de carregamento de proteínas. A análise densitométrica de immunoblots revelou que as células acumularam níveis mais elevados de RecA sob condições de crescimento hipóxico em comparação com condições aeróbias (Fig. 2A,B). Uma análise comparativa mostrou que as células acumularam consistentemente níveis 2 vezes mais altos de RecA nas fases intermediárias do registro em relação à fase inicial do registro sob condições de crescimento aeróbio, que diminuiu na fase estacionária para níveis observados na fase inicial do registro (Fig. 2A,B). Um padrão semelhante foi observado para o RecX, embora os níveis fossem menos pronunciados que os do RecA (Fig. 2A,C). Embora os padrões de expressão do mRNA e da proteína fossem comparáveis, foram observadas diferenças importantes. Primeiro, a proteína RecX foi dificilmente detectável na fase inicial de registro durante condições hipóxicas. Em segundo lugar, a abundância de mRNA e proteína RecA foi maior em comparação com RecX.

(A) Níveis de expressão das proteínas M. smegmatis mc2155 RecA e RecX sob condições de crescimento aeróbico e hipóxico. (B) Quantificação das alterações relativas dos níveis de proteína RecA sob condições de crescimento aeróbico e hipóxico. (C) A quantificação das mudanças relativas nos níveis de RecX sob condições de crescimento aeróbico e hipóxico. Os histogramas representam os valores médios determinados pela quantificação de florações ocidentais a partir de três experimentos independentes. O controle de carga GroEL foi utilizado para normalização dos níveis de expressão RecA e RecX. As barras de erro representam o erro padrão da média calculada a partir de 3 réplicas independentes. Diferenças significativas são indicadas por **p < 0,01, e *p < 0,05. ns, não significativas.

Al embora, estes resultados sugiram que os genes M. smegmatis recA e recX são induzidos sob condições hipóxicas, não há correlação entre a quantidade de mRNA recX e a proteína correspondente na fase de registro precoce. Tanto o M. tuberculosis quanto o M. smegmatis mostraram estabilizar suas transcrições de mRNA sob condições de inibição de crescimento58,59,60. Entre os mecanismos possíveis, a reprogramação do RNAt e a tradução seletiva do códon tendenciosa têm demonstrado um papel nas micobactérias em resposta à hipóxia61. Uma possível explicação para a falta de correlação entre o mRNA recX e o nível de proteína na fase inicial de log poderia ser a devida repressão translacional do mRNA recX.

Construção de ΔrecX e ΔrecA ΔrecX estirpes mutantes

A diferença nos níveis de proteína RecA e RecX em M. smegmatis indica uma possível regulação da expressão gênica no nível de transcrição. Em muitas bactérias estudadas até agora, o gene recX está localizado na mesma cadeia de codificação a jusante do recA e os dois genes são co-transcricionados48,50,53,54,62,63. No entanto, no locus lexA-recA-recX dos patovares Xanthomonas, cada gene é expresso a partir do seu próprio promotor64. Além disso, em D. radiodurans65,66, B. subtilis67 e N. gonorrhoeae26, os genes recA e recX são separados por várias centenas de kb de comprimento e transcritos de seus próprios promotores.

Em várias espécies de micobactérias, assim como em algumas outras bactérias, a região 5′ da sequência de codificação recX sobrepõe-se à região 3′ do gene recA. A sobreposição tem 32 bp de comprimento no M. smegmatis48, enquanto no M. tuberculosis68 e M. leprae69 a sobreposição é de 35 bp. O efeito da deleção recX sobre as características fenotípicas tem sido estudado em vários organismos7,10. Os mutantes eliminadores de recX mostram uma gama de fenótipos associados às funções RecA: a inativação de B. subtilis recX tornou as células sensíveis a MMS e H2O225, os S. lividans recX mutantes mostraram uma diminuição na resistência aos danos UV42 e o N. gonorrhoeae recX mutante mostrou uma pequena diminuição na sua capacidade de sobreviver a danos no DNA que foram causados por quebras de dupla cadeia26. Entretanto, o impacto da deleção dos genes recA e recX sobre as características de crescimento e reparação de danos no DNA não foi investigado em nenhum organismo. Além disso, um entendimento completo do papel in vivo do recX em micobactérias não foi completamente compreendido.

Estudos anteriores demonstraram que a estirpe M. smegmatis ΔrecA exibiu sensibilidade a danos no DNA induzidos por UV e não promove a FC52. Nós combinamos a mutação recA com a eliminação da recX para investigar os efeitos das mutações duplas. Para este fim, foram geradas estirpes de M. smegmatis mc2155 recX simples e recArecX duplo mutante. Como controle, o efeito da eliminação recA no M. smegmatis foi reavaliado para comparação direta. Usando o método de recombinação, que é baseado em um protocolo desenvolvido para o M. tuberculosis e M. bovis BCG28, os mutantes M. smegmatis mc2155 ΔrecA e ΔrecAΔrecX foram gerados usando-se 3,279 kb e 3,302 kb lineares ΔrecA::hyg e ΔrecAΔrecX::hyg AES construídos, respectivamente. Aproximadamente 100 ng de fragmentos lineares de DNA AES foram gerados por digestão de restrição dos respectivos plasmídeos com EcoRV (Fig. 3A). Estes foram transformados em células recombinadoras competentes M. smegmatis mc2155:pJV5370. Após 4-5 dias de incubação, foram encontradas 8-10 colônias resistentes a Hyg- para os mutantes ΔrecX e ΔrecAΔrecX. As cepas mutantes putativas foram rastreadas usando PCR para determinar se os genes recX e recArecX foram apagados do cromossomo (dados não mostrados). Os mutantes corretos foram cultivados no meio ágar Middlebrook 7H10 por 5-8 gerações para permitir a perda do pJV53.

Isolamento de M. smegmatis mc2155 ΔrecX e ΔrecA ΔrecX cepas mutantes. (A) mapa físico das regiões M. smegmatis recA recX, ΔrecAΔrecX e ΔrecX. As linhas horizontais com pontas de seta em ambas as extremidades representam o tamanho do fragmento de DNA genômico entre os sites de restrição NdeI e SalI correspondentes ao tipo selvagem, ΔrecA ΔrecX e ΔrecX estirpes. Os símbolos dos relâmpagos indicam os locais de reconhecimento para as enzimas de restrição indicadas. As pequenas caixas pretas (adjacentes ao local de reconhecimento do NdeI) indicam sondas de hibridação usadas em experimentos de blotting sul. (B) Análise de DNA genômico do tipo “Southern blotting” do tipo selvagem e das cepas ΔrecX. Pistas 1 e 4, marcadores de peso molecular; 2, DNA genômico da estirpe selvagem; 3, DNA genômico da estirpe ΔrecX. (C) Análise do ADN genómico do tipo selvagem e das estirpes ΔrecAΔrecX. Linha 1, marcadores de peso molecular; 2, DNA genômico da linhagem selvagem; 3, DNA genômico da linhagem ΔrecAΔrecX dupla mutante.

Análise genotípica e fenotípica da linhagem M. smegmatis ΔrecX e ΔrecAΔrecX mutantes

Após a triagem por PCR, foram obtidos 2 mutantes eliminados de M. smegmatis mc2155 em cada um dos grupos ΔrecX e ΔrecAΔrecX. Os mutantes de ΔrecX e ΔrecAΔrecX foram caracterizados por mapeamento enzimático de restrição e hibridização de Southern blot (Fig. 3). Após a hibridação com sondas radiolabeladas apropriadas, um fragmento de 4,1 kb foi visto no caso de células M. smegmatis mc2155 do tipo selvagem. Os fragmentos previstos de 3,14 kb e 2,09 kb foram observados nos mutantes ΔrecX e ΔrecAΔrecX respectivamente (Fig. 3B,C). Essas duas bandas são menores que 4,1 kb, indicando que os genes recX e recArecX foram deletados por substituição alélica. A frequência de troca alélica com respeito ao recX e recArecX estava na faixa de 70% e 80% respectivamente.

Uma ressalva desta análise é que os efeitos observados das mutações ΔrecX e ΔrecAΔrecX poderiam resultar dos efeitos polares da inserção do gene de resistência à higromicina. Em geral, alterações genéticas em torno do locus recA-recX poderiam levar a efeitos polares na expressão de genes a jusante do locus recA-recX. Duas experiências independentes foram realizadas para investigar os potenciais efeitos polares. Primeiro, os mutantes ΔrecX e ΔrecAΔrecX foram complementados com as cópias funcionais dos genes recA e recX. Os transformantes foram avaliados quanto à sua capacidade de crescer num meio de cultura padrão e proteger as células mutantes contra a irradiação UV. Diluições em série de dez vezes foram detectadas em placas de ágar 7H10 e analisadas. Como mostrado na Fig. 4A,B, o tipo selvagem recA complementou parcialmente as cepas mutantes ΔrecA e ΔrecAΔrecX, como deduzido de sua capacidade de suportar o crescimento e fornecer proteção contra a irradiação UV. Entretanto, o tipo selvagem recX não conseguiu resgatar o fenótipo das cepas mutantes ΔrecAΔrecX observadas na indução de danos no DNA com a irradiação UV. Uma vez que a eliminação do recX não teve qualquer efeito perceptível no seu crescimento em condições normais e prejudiciais para o ADN, ΔrecX e a sua estirpe complementar correspondente mostrou um crescimento semelhante ao do tipo selvagem.

Inserção de um gene de resistência à higromicina em M. smegmatis mc2155 recA-recX locus não exerce efeito polar. Os precA e precX denotam o pVV16-vector com uma cópia funcional do gene recA ou recX sob o controlo do promotor constitutivo Hsp60. EV denota o vetor vazio pVV16. precA e precX indicam plasmídeos contendo cópias do tipo selvagem dos genes M. smegmatis recA e recX, respectivamente. Estes foram transformados nas cepas de tipo selvagem e mutante indicadas. Complementação de M. smegmatis mc2155ΔrecA ΔrecX e ΔrecX cepas mutantes para crescimento aeróbico (painel A) e sensibilidade contra irradiação UV (painel B) com plasmídeos portadores de alelos do tipo selvagem de M. smegmatis recA ou recX. (C), análise quantitativa por PCR em tempo real de genes em torno do locus recA-recX do M. smegmatis mc2155 de estirpes do tipo selvagem e mutante. As barras de erro representam o erro padrão da média calculada a partir de 3 réplicas independentes. Diferenças significativas são indicadas por ns, não significativas.

Segundo, avaliamos a expressão de dois M. smegmatis mc2155 genes, gluD (MSMEG_2725) e glnH (MSMEG_2726), localizados a jusante do recA recX locus no ΔrecA ΔrecX e ΔrecX estirpes mutantes em comparação com a estirpe do tipo selvagem. O gene M. smegmatis hyd2 (MSMEG_2720), localizado a montante do locus recA-recX, foi usado como controle positivo. O RNA total foi preparado a partir das cepas do tipo selvagem, ΔrecA ΔrecX e ΔrecX cepas mutantes. As abundâncias relativas das transcrições do gene foram determinadas por RT-qPCR quantitativo e normalizadas para o gene rRNA do cromossomo 16S expresso constitutivamente. Os níveis de expressão foram medidos a partir de células cultivadas na fase de crescimento exponencial tardio. Em todos os casos, os perfis de expressão gênica dos ORFs a montante e a jusante foram similares para as linhagens do tipo selvagem e mutante (Fig. 4C). Em conjunto, estes resultados excluem a possibilidade da inserção do gene de resistência à higromicina causar efeitos polares.

O M. smegmatis ΔrecA e ΔrecA ΔrecX as cepas mutantes mostram crescimento prejudicado e rendimento celular reduzido em relação à cepa do tipo selvagem

Para caracterizar a cepa M. smegmatis ΔrecX e ΔrecA ΔrecX estirpes mutantes, os perfis de crescimento das estirpes do tipo selvagem e das estirpes knockout foram medidos no caldo Middlebrook 7H9 a 37 °C (Fig. 5). A eliminação recX não teve nenhum efeito discernível (comparado com a estirpe selvagem) sobre o crescimento do M. smegmatis. Em condições similares, a deleção recA aumentou acentuadamente a duração da fase de atraso e concomitantemente reduziu a fase de crescimento exponencial, sugerindo que o recA desempenha um papel no crescimento e viabilidade do M. smegmatis. Além disso, esses resultados são consistentes com a função conhecida do recA no resgate de garfos de replicação estagnados ou colapsados71,72,73. Como os genes RecA e RecX formam um único ópero, foi investigado o impacto de sua deleção no crescimento do M. smegmatis. A linhagem ΔrecA ΔrecX knockout mostrou um fenótipo de crescimento que era intermediário entre a linhagem mutante ΔrecA e a linhagem do tipo selvagem; entretanto, o crescimento nas fases tardia de registro e estacionária foi semelhante ao de ΔrecA e das linhagens do tipo selvagem.

A cinética de crescimento da estirpe M. smegmatis mc2155 do tipo selvagem, ΔrecA e ΔrecA ΔrecX e ΔrecX estirpes em condições normais de crescimento. Cada ponto de dados é a média de três experimentos independentes e as barras de erro representam desvios padrão dos valores médios.

Apagamento do recA, mas não do recX, torna o M. smegmatis mais suscetível a agentes danificadores do DNA

Semelhante a outras eubactérias, a proteína micobacteriana RecA desempenha um papel crucial na regulação da resposta do SOS sobre os danos do DNA74,75,76,77. Para testar se a ausência de recArecX e recX afecta a capacidade da M. smegmatis de reparar eficazmente o ADN danificado, os mutantes foram expostos a uma gama de agentes com mecanismos variados de danos no ADN. Nestas experiências, o stress foi induzido pela exposição das estirpes mutantes ΔrecA, ΔrecX e ΔrecA ΔrecX à radiação UV, MMS, H2O2 ou ciprofloxacina durante a fase exponencial (OD600 de 0,6) do crescimento da bactéria. Após 3 h de incubação, as células foram lavadas e a sua viabilidade foi testada por meio da observação de diluições em série dez vezes maiores das culturas em placas de ágar Middlebrook 7H10 contendo higromicina (100 µg/ml). A concentração/dose mais apropriada dos agentes danificantes do DNA foi determinada após a avaliação das diferenças de viabilidade celular entre as cepas através de ensaios com placas. Na ausência de agentes nocivos ao DNA, todas as cepas exibiram níveis similares de viabilidade celular (Fig. 6). Em contraste, na presença de agentes danificadores de DNA, a cepa ΔrecA mostrou um pronunciado defeito de crescimento acompanhado de uma diminuição de 100 vezes na eficiência de revestimento em relação à cepa do tipo selvagem. Este fenótipo é consistente com a literatura disponível. Em contraste, o efeito letal da UV, MMS ou ciprofloxacina, mas não do H2O2, foi parcialmente bloqueado pela eliminação do gene recX na estirpe ΔrecA. Embora a base para a falta do efeito H2O2 não seja clara, a concentração utilizada provavelmente não foi suficientemente elevada para afectar o crescimento. Curiosamente, a estirpe ΔrecX exibiu um fenótipo ligeiramente mais resistente contra os quatro agentes nocivos ao DNA do que a estirpe ΔrecA ΔrecX, indicando um possível ganho de função devido à perda do gene recX. Dados estes resultados, é aparente que o recA desempenha um papel ativo na resposta SOS e que a sensibilidade dos agentes prejudiciais ao DNA é ligeiramente suprimida na estirpe ΔrecX.

Efeito dos agentes prejudiciais ao DNA na sobrevivência da estirpe M. smegmatis mc2155 do tipo selvagem e ΔrecA, ΔrecA ΔrecX e ΔrecX. As placas foram expostas: (A) cinco J/m2 luz UV; (B) 0,01% MMS; (C) 1 mM H2O2 e (D) 5 μM ciprofloxacina. O controlo representa o crescimento de estirpes sem qualquer agente nocivo ao ADN. Os resultados são dados representativos (n = 3) de três experimentos independentes.

Survival após tratamento com diferentes concentrações de agentes nocivos ao DNA

Micobactérias experimentam uma série de condições adversas de estresse, tais como estresse oxidativo, nutricional e induzido por drogas78,79,80,81,82. Para explorar melhor as diferenças de viabilidade celular, foram realizadas experiências nas quais a viabilidade celular foi medida por unidades formadoras de colónias (UFC). Primeiro, a viabilidade do M. smegmatis mc2155 ΔrecA, ΔrecX e ΔrecAΔrecX mutantes foram testados em comparação com os do tipo selvagem, desafiando-os com concentrações crescentes de MMS. As cepas foram cultivadas na presença das concentrações indicadas de MMS, até que as culturas atingissem uma OD600 de 0,6. A viabilidade celular foi testada através de placas pré-determinadas de células em placas de ágar 7H10. As células foram julgadas vivas se fossem capazes de se dividir e formar colônias. Os mutantes, ao contrário da estirpe do tipo selvagem, mostraram maior sensibilidade à MMS de uma forma dependente da concentração. A análise quantitativa indicou que o mutante ΔrecA mostrou uma sensibilidade relativamente maior à MMS, que aumentou com o aumento das concentrações de MMS (Fig. 7A). No caso do ΔrecX, as células eram ~2 vezes menos sensíveis à MMS em comparação com as células ΔrecA. Por outro lado, a mutante ΔrecA ΔrecX mostrou maior sensibilidade à MMS, em contraste com a mutante ΔrecX. A sensibilidade do ΔrecX mutante ao MMS indica que o RecX pode ter ainda alvos não identificados, além do RecA. Esta suposição precisa de mais investigação.

Sobrevivência de culturas em fase exponencial expostas a uma ampla gama de concentrações crescentes de agentes prejudiciais ao DNA. A sobrevivência de cepas do tipo selvagem M. smegmatis, ΔrecA, ΔrecA ΔrecX e ΔrecX foi investigada através da determinação do número de UFC. (A) A sobrevivência das células tratadas com (A), MMS; (B) H2O2; (C) radiação UV e (D) ciprofloxacina. As barras de erro representam o erro padrão da média calculada a partir de 3 réplicas independentes. As diferenças significativas são indicadas por *p < 0,05; **p < 0,01 e ***p < 0,001. ns, não significativas.

Nextra, as sensibilidades do M. smegmatis mc2155 ΔrecA, ΔrecX e ΔrecA ΔrecX as cepas mutantes em relação à cepa do tipo selvagem foram determinadas expondo-as a concentrações crescentes de H2O2. Os resultados mostram que a mutante ΔrecA foi menos sensível a este tratamento (Fig. 7B). A eliminação apenas do recX, ou eliminação do locus recA-recX, teve apenas um efeito menor na viabilidade e proliferação de células mutantes em resposta ao tratamento de H2O2. Notadamente, as cepas mutantes ΔrecA e ΔrecAΔrecX apresentaram um fenótipo de crescimento sensível à irradiação UV e à ciprofloxacina que é significativamente mais grave do que à MMS ou H2O2 (Fig. 7C,D). Além disso, a linhagem ΔrecA mostrou maior sensibilidade à irradiação UV e à ciprofloxacina do que a ΔrecA ΔrecX linhagem mutante dupla.

A expressão dos genes recA e recX são induzidos por danos no DNA

Os elementos reguladores a montante do gene recA não são conservados em todas as espécies micobacterianas. Por exemplo, o gene recA do M. tuberculosis é transcrito a partir de dois promotores: ambos são induzíveis a danos no DNA, embora através de mecanismos diferentes. O promotor P1 do M. tuberculosis recA (proximal ao códon inicial) pode ser induzido após dano de DNA independente das proteínas LexA e RecA. Em contraste, o promotor P2 (localizado longe do códon inicial do recA) é regulado pelo LexA, que é funcionalmente análogo ao promotor E. coli recA83,84,85. Curiosamente, o mecanismo de indução de danos de DNA no M. tuberculosis não é totalmente conservado no M. smegmatis46,75. Estes achados enfatizam a necessidade de entender a expressão e regulação dos genes M. smegmatis recA e recX e seus papéis em resposta aos agentes nocivos ao DNA.

Como descrito acima, a hipoxia causou um aumento na expressão dos genes M. smegmatis recA e recX (Fig. 1). Para corroborar ainda mais a noção de que a expressão dos genes M. smegmatis recA e recX é induzível a danos, a cinética da indução com e sem danos ao DNA foi determinada usando RT-qPCR. As amostras totais de RNA foram preparadas a partir de células de M. smegmatis colhidas às 0, 3, 6, 9 e 12 h após exposição à luz UV, bem como de culturas não tratadas e analisadas como descrito na seção Métodos. Os resultados não revelaram diferenças significativas entre os níveis de recA e recX transcript nas células não tratadas. Em contraste, um aumento acentuado nas transcrições recA e recX mRNA foi observado 3 h após a exposição à radiação UV, e em seguida diminuiu ligeiramente. Uma comparação dos dados RT-qPCR indica diferenças importantes entre os níveis de recA e recX transcript. A exposição à radiação UV levou a um aumento de ~8 vezes no recA mRNA sobre controle, enquanto o recX por ~3 vezes (Fig. 8A,B). Assim, embora recA e recX mRNA existam na mesma unidade transcripcional, estes resultados apoiam a ideia de que a produção e/ou estabilidade do recX mRNA transcript está sujeita a um mecanismo regulador adicional pós-transcricional.

A radiação UV induz a expressão de recA e recX em M. smegmatis. (A) cinética do acúmulo de recA mRNA em controle e após a exposição à radiação UV; (B) cinética do acúmulo de recX mRNA em controle e após a exposição à radiação UV. (C) Florações ocidentais representativas mostrando a cinética do acúmulo de proteínas RecA e RecX em células M. smegmatis controladas e induzidas pela radiação UV. (D,E) Quantificações dos dados de Western blot mostrados no painel C. As barras de erro representam o erro padrão da média calculada a partir de 3 réplicas independentes.

Estes resultados nos levaram a realizar experimentos adicionais para determinar a cinética do acúmulo de proteínas RecA e RecX em células de M. smegmatis com ou sem danos ao DNA. Foram realizados ensaios de “Western blotting” em lisados celulares inteiros usando anticorpos policlonais levantados contra RecA e RecX (Fig. 8C). A quantificação de Western blotting mostrou que as células continham quantidades significativas de proteínas RecA e RecX em células não induzidas (Fig. 8D,E). Em comparação, a abundância de RecA e RecX (over control) aumentou 2 vezes nas células 3 h após a exposição à radiação UV e diminuiu em seguida. Importante, a indução das proteínas RecA e RecX exibiu um padrão que lembra o observado em células sob condições hipóxicas (Fig. 2), embora os mecanismos pelos quais elas danificam o DNA sejam provavelmente diferentes.

Observações finais

Muitos estudos demonstraram que recA e recX desempenham uma ampla gama de funções relacionadas à reparação e recombinação do DNA7,10. Para nosso conhecimento, os estímulos que ativam a expressão dos genes M. smegmatis recA e recX não foram identificados. Neste estudo, os níveis de expressão destes genes foram avaliados em células em crescimento aeróbico e em resposta a várias condições de estresse. No M. smegmatis, semelhante a muitas espécies bacterianas, recA e recX pertencem ao mesmo operon, e o gene recX está localizado imediatamente abaixo do gene recA, e compartilha regiões codificadoras sobrepostas86. Descobriu-se que agentes nocivos ao DNA induziram a expressão de ambos os genes em diferentes extensões; entretanto, as razões de expressão seguem um padrão similar. Curiosamente, os níveis de RecA e RecX permanecem altos sob condições de estresse em comparação às condições de crescimento aeróbio.

Estudos transversais têm demonstrado papéis alternativos para o recX no reparo do DNA recombinacional promovido pelo RecA. Enquanto a proteína RecX interage fisicamente com RecA, e funciona como um potente inibidor de todas as funções conhecidas desta última em muitas espécies bacterianas14,46,48, ela potencializa a recombinação homóloga em N. gonorrhoeae e B. subtilis25,26. Para obter insights sobre o papel do recX na resposta ao estresse em micobactérias, foram construídos mutantes knockout de M. smegmatis recX e recArecX. Curiosamente, a eliminação do recX no M. smegmatis resultou em um fenótipo ligeiramente mais resistente contra todos os quatro agentes danificadores do DNA, indicando um possível ganho de função devido à perda do gene recX. A base molecular deste efeito não é clara, o que parece valer a pena explorar em estudos futuros. Enquanto nossa análise foi focada principalmente na interação genética entre recA e recX no caminho de reparação do DNA recombinacional, curiosamente, o recX parece desempenhar um papel importante no crescimento bacteriano. Em resumo, estas descobertas são consistentes com a ideia de que M. smegmatis recX desempenha um papel importante nos processos de reparação/recombinação de ADN sob condições adversas, talvez regulando os efeitos prejudiciais de um subconjunto dos genes ainda desconhecidos.

As abreviações usadas são

DTT, ditiotreitol; EDTA, ácido etileno diamina tetraacético; kb, kilobase; MMS, sulfonato de metilmetano; ODN, oligonucleotídeo; PAGE, electroforese em gel de poliacrilamida; PVDF, membrana difluoreto de polivinilideno; RT-qPCR, transcrição reversa quantitativa da reacção em cadeia da polimerase; SDS, sulfato de sódio dodecilo; ssDNA, ADN de cadeia única; SSC, 0.15 M NaCl-0,015 M citrato de sódio (pH 7,0) tampão.