Neste trabalho, apresentamos uma análise computacional para abordar a questão da existência de diferenças no espectro fenotípico das doenças associadas aos genes nas fases de Síntese e Transamidase+Remodelagem da biossíntese de âncoras GPI (Fig. 1). Realizamos primeiramente uma revisão abrangente da literatura de todos os relatos de casos publicados sobre indivíduos diagnosticados com doenças causadas por variantes de um gene da via de ancoragem GPI. Em seguida, extraímos as informações do paciente, informações sobre mutações e todos os dados fenotípicos sobre cada paciente usando termos da HPO (Tabelas 1 e 2). Dados clínicos de 58 publicações foram incluídos neste estudo, compreendendo um total de 152 pacientes individuais para os quais estavam disponíveis descrições fenotípicas detalhadas, representando IGDs associadas a um total de 22 genes envolvidos na via de biossíntese GPI (Arquivo adicional 1: Tabela S1).
Síntese vs. Transamidase+Fenótipos remodeladores
Dividimos a via de biossíntese GPI em estágios de Síntese e Transamidase+Remodelação. Enzimas no Grupo de Síntese mediam a montagem da espinha dorsal do precursor GPI na membrana do retículo endoplasmático (ER). Enzimas no Grupo Transamidase+Remodelagem facilitam o acoplamento do GPI ao términus C de uma proteína recém-sintetizada dentro da luz do RE, clivagem de um peptídeo de sinal de adição de GPI terminal, e permitem modificações lipídicas e da cadeia lateral de carboidratos que regulam o tráfico de GPI-AP do RE para a membrana plasmática (Fig. 1, Tabelas 1 e 2).
Comparamos as anormalidades fenotípicas em pacientes com mutações nos genes dos grupos Síntese e Transamidase+Remodelação. Vários fenótipos esqueléticos foram significativamente mais propensos a ocorrer em pacientes com mutações no estágio de Síntese da via biossintética (Grupo de Síntese). O Grupo Síntese teve uma maior ocorrência (33% dos pacientes) de morfologia de dígitos anormais (termos da HPO listados usando itálico). Outros fenótipos observados nos pacientes do grupo Synthesis foram Ausência de falanges distais, Aplasia/Hipoplasia de dedos, Dígito curto, Dedo largo e dedo do pé largo, Clubbing, Clinodactilia, e outras anormalidades (Tabela 3). Os pacientes do grupo Transamidase+Remodelagem (pacientes com mutações nos genes de fase posterior) tiveram menos incidências de morfologia anormal dos dígitos (6,7%, Tabela 3). Por exemplo, pacientes do Grupo de Síntese têm estatisticamente mais probabilidade de ter um dígito curto (24% dos pacientes), enquanto apenas um indivíduo (< 2%) foi indicado como tendo um dígito curto no Grupo Transamidase+Remodelagem (Tabela 3).
Mais ainda, os pacientes do Grupo de Sínteses tinham significativamente mais probabilidade de apresentar morfologia muscular anormal, morfologia tendinosa anormal, e/ou morfologia articular anormal. Isto estava relacionado principalmente com o termo contractura de flexão ou seus descendentes (Fig. 2). Dezoito dos noventa e três pacientes do grupo Síntese tiveram uma contratura de flexão de uma ou mais articulações (descendente de contratura de flexão). Uma “contractura” é um encurtamento ou endurecimento do músculo ou tendão que leva à perda de movimento dessa articulação e, portanto, é listada sob as hierarquias musculares, tendinosas e articulares da HPO. Além das contraturas de flexão, um punhado de outros tipos de fenótipos acrescenta significado a essas classes de pais. Um paciente do Grupo de Síntese mostrou anormalidade do tendão de Aquiles, que é uma criança com morfologia tendinosa anormal. Quanto à Anormalidade da morfologia articular, um único paciente apresentou pteria axilar, que é a presença de uma membrana cutânea na axila. Além disso, vários pacientes do Grupo de Síntese e um único paciente do Grupo de Transamidase+Remodelagem apresentavam hipermobilidade articular (Tabelas 1 e 2). Além das contraturas, vários outros fenótipos observados contribuíram para que o fenótipo de morfologia muscular anormal estivesse significativamente aumentado no Grupo de Síntese. Tais fenótipos incluem Distrofia Muscular, Camptodactilia, Amiotrófia generalizada, Macroglossia, Miopatia, Vacuoles Rimmed, Divisão das fibras musculares, Atrofia muscular esquelética, Músculo anormal e expressão da distrofina das fibras. Dois pacientes do grupo Transamidase+Remodelagem observaram morfologia muscular anormal, mas este grupo difere nos tipos de fenótipos relatados (Atrofia muscular esquelética e aumento do conteúdo lipídico muscular).
Exemplo da hierarquia da HPO. A hierarquia da HPO para palato fendido e fenótipos vizinhos
Transamidase+Remodelagem de pacientes do grupo, em geral, exibiram anormalidades fenotípicas mais diversas que afetaram seletivamente esta população, ao contrário do grupo de Síntese (Tabelas 3 e 4). As alterações mais comuns foram no desenvolvimento ósseo e facial e deficiências de desenvolvimento neurológico. A frequência de anormalidade da densidade óssea é significativamente maior nos pacientes do Grupo Transamidase+Remodelagem, em comparação com os pacientes do Grupo Síntese. A Osteopenia, redução da densidade mineral óssea abaixo do normal, mas não tão grave quanto a Osteoporose, ocorreu em 22% dos pacientes do grupo Transamidase+Remodelagem, enquanto apenas 2% dos pacientes do grupo Síntese foram relatados como portadores de Osteopenia. A osteopenia contribui quase totalmente para a significância identificada em pacientes do grupo Transamidase+Remodelagem com densidade mineral óssea reduzida (termo de progenitor), Anormalidade da densidade mineral óssea (termo de avós), Ossificação óssea anormal (termo de bisavós) e Estrutura óssea anormal (termo de tataravós). Os únicos fenótipos adicionais de estrutura óssea anormal observados foram uma córtex óssea fina observada em um único paciente do grupo Síntese, e dois pacientes apresentaram Redução da densidade mineral óssea e Osteoporose em um paciente do grupo Transamidase+Remodelagem (Tabela 4).
Simplesmente, os pacientes do grupo Transamidase+Remodelagem, predominantemente pacientes com mutações PGAP3, têm uma probabilidade significativamente maior de ter Macrotia. Os pacientes do Grupo Transamidase+Remodelagem foram classificados como tendo Macrotia (orelhas grandes maiores que 2x o desvio padrão) 25% do tempo, enquanto a incidência foi de apenas 2% para os pacientes do Grupo Síntese. A grande maioria desses pacientes do Grupo Transamidase+Remodelagem foi descrita como tendo especificamente Grandes orelhas carnudas, uma criança de Macrótia (Tab. 4).
Outras anormalidades de desenvolvimento facial encontradas nos pacientes do Grupo Transamidase+Remodelagem foram pacientes com morfologia do palato duro anormal e seu termo infantil, Fenda Palatina. Ambos os fenótipos ocorreram com frequência significativamente maior no grupo Transamidase+Remodelagem em relação ao grupo Síntese (29% vs. 6% dos pacientes) (Tab. 4, Fig. 2). O fissurado palatino foi o fenótipo predominante nos 16 pacientes do grupo Transamidase+Remodelagem (vs. 6 pacientes do grupo Síntese), o que resultou tanto na morfologia anormal do palato duro quanto no fato de o fissurado palatino ter alcançado significância. Adicionalmente, dois pacientes do grupo Transamidase+Remodelagem foram descritos como tendo lábio e palato fendidos medianos, bisneto de fenda palatina, o que também contribuiu para a significância desses dois fenótipos (Tabela 4, Fig. 2). Como o termo Fissuras palatinas tem múltiplos pais na HPO, a fissura oral também foi identificada como seletivamente enriquecida em pacientes do Grupo Transamidase+Remodelagem. Além dos fenótipos já citados, o significado do termo Fenda Oral derivada do lábio superior e do lábio leporino (Tabela 4, Fig. 2).
Numeros pacientes de ambos os grupos apresentam anormalidade nasal, mas os pacientes do grupo Transamidase+Remodelagem tiveram significativamente mais chances de apresentar alterações no nariz (Grupo Síntese = 28% vs. Grupo Transamidase+Remodelagem = 61%). Ambos os grupos apresentam anormalidades no nariz, sendo a ponta nasal larga e a ponte nasal larga as mais comuns em cada grupo. Embora muitas das anormalidades do nariz estejam presentes em ambos os grupos, o nariz proeminente só foi encontrado no Grupo Transamidase+Remodelagem (15%). O nariz proeminente parece estar fortemente associado a mutações no PGAP3 e só foi relatado nesses pacientes. Um paciente do Grupo Síntese teve uma ponte nasal proeminente (Tabela 4).
Existem numerosos fenótipos mentais e cognitivos que afetam ambos os grupos, entretanto, o Grupo Remodelador parece ter sido impactado com maior freqüência. Enquanto ambos os grupos têm uma grande porcentagem de pacientes com anormalidade de desenvolvimento neurológico, 98% do grupo Transamidase+Remodelagem foram notados com anormalidade de desenvolvimento neurológico, em oposição a 73% do grupo Síntese. Mais especificamente, o Grupo Transamidase+Remodelagem teve uma incidência maior de atraso no desenvolvimento neurológico, incapacidade intelectual e anormalidade comportamental (92, 66 e 42%, respectivamente), enquanto o Grupo Síntese teve uma população significativamente menor com essas anormalidades (61, 16 e 15%, respectivamente) (Tabela 4).
A divisão que escolhemos entre os Grupos Síntese e Transamidase+Remodelagem é apenas uma das muitas formas possíveis de dividir a via GPI, e raciocinamos que outras partições poderiam apresentar outras diferenças fenotípicas. Para explorar isso, definimos um grupo composto pelos genes de síntese GPI, bem como pelos genes do complexo transamidase (Grupo Síntese+Transamidase) e comparamos com os genes responsáveis pela remodelação de ácidos graxos (Grupo Remodelação). O grupo Remodelação consiste nos genes PGAP1, PGAP3, PGAP2 e PGAP5 (um subconjunto do grupo original Transamidase+Remodelação). O Grupo Síntese+Transamidase mostrou enriquecimento das anomalias do trato urinário. O grupo Remodelação mostrou enriquecimento para alguns dos mesmos termos que no grupo Transamidase+Remodelação, incluindo Anomalia Comportamental, Atraso Neurodevelopmental, Anormalidade do Palato Duro, Fenda Oral e Fenda Palatina. Além disso, o grupo Remodelador apresentou Diminuição da circunferência da cabeça, Alteração da localização dos olhos, Anormalidades de morfologia da orelha e pálpebra, Grande ponte nasal, Anormalidades do lábio superior e Fosfatase alcalina elevada (arquivo adicional 1: Tabela S3).
Genes causais candidatos para os fenótipos componentes das IGDs
Mutações nos genes que codificam as enzimas da via de biossíntese GPI resultam em visibilização dos GPI-APs , mas a distribuição anormal dos GPI-APs nas IGDs não tem sido caracterizada em detalhes. Nossa hipótese é de que o mal-direcionamento e, portanto, o mal-direcionamento de GPI-APs individuais leva à disfunção das proteínas visadas que, por sua vez, leva a algumas ou todas as anormalidades fenotípicas observadas nas IGDs. Uma melhor compreensão do mis-argeting de GPI-APs poderia, portanto, esclarecer a patogênese molecular das IGDs e lançar luz sobre as correlações genótipo-fenótipo.
Mais de 142 proteínas humanas foram identificadas em UniProt como sendo GPI-anchored (Arquivo adicional 1: Tabela S2). Destes, 23 (ou 16%) destes genes codificadores para GPI-APs foram associados a pelo menos uma doença Mendeliana (um total de 34 doenças Mendelianas foram identificadas), e portanto, numerosos fenótipos que definem estas doenças. Não observámos um enriquecimento significativo dos termos da Ontologia Genética para os genes, nem um enriquecimento dos termos da Ontologia do Fenótipo Mamífero (incluindo a letalidade embrionária) entre os ortologistas destes genes (dados não mostrados). Trinta e quatro fenótipos em pacientes com mutações em genes ancorados em GPI se sobrepõem aos fenótipos dos pacientes com CDG (Tabela 1 e 2). O fato de que a mutação do gene GPI-biossíntese e as mutações do gene GPI-anchored podem causar sobreposição, mas não fenótipos idênticos, é esperado uma vez que mutações na via GPI-biossíntese provavelmente alterariam a atividade e função de um número de proteínas GPI-anchored, e portanto, múltiplas vias de sinalização.
Para aprofundar as vias afetadas pelas mutações do gene GPI-biossíntese, investigamos os fenótipos que foram observados como sendo mais freqüentes nos grupos Síntese ou Transamidase+Remodelagem. No grupo Síntese, foram comparados genes associados aos 5 fenótipos característicos (Tabela 3). Um total de 102 genes foram associados a doenças mendelianas que compartilham cada um dos cinco fenótipos característicos (arquivo adicional 1: Figura S1).
Ao comparar os genes associados ao Grupo Transamidase+Remodelagem, dois genes foram associados a 15 dos 16 fenótipos do Grupo Transamidase+Remodelagem enriquecidos: tirosina receptora do fator de crescimento fibroblástico (FGFR2), e um parceiro de sinalização a jusante, B-Raf (BRAF) (arquivo adicional 1: Figura S2). FGFR2 e B-Raf estão associados a todos os fenótipos do Grupo Transamidase+Remodelagem, exceto Grandes orelhas carnudas. Notavelmente, estes genes estão associados ao termo pai de Grandes Orelhas Carnosas, Macrótia. A exclusão de Grandes orelhas carnudas pode ser devida ao fato de que os pacientes apresentam orelhas grandes mas não Grandes orelhas carnudas, ou pode ser devido à especificidade em que os médicos estão apresentando os dados dos pacientes ou os detalhes registrados pelos curadores e pesquisadores. As mutações no FGFR2 estão associadas a mais de dez doenças distintas, incluindo a síndrome de Pfeiffer e a síndrome de Crouzon. As mutações na FGFR2 estão associadas a sete doenças, incluindo a síndrome de Noonan tipo 7 e a síndrome Cardiofaciocutânea.
Embora nem a FGFR2, uma proteína de membrana, nem a B-Raf tenha sido identificada como GPI-APs, a FGFR2 tem se mostrado associada a jangadas lipídicas em oligodendrócitos e osteoblastos e a translocação B-Raf ocorre mais rapidamente na presença de jangadas lipídicas . Os GPI-APs estão associados a jangadas lipídicas sugerindo que este pode ser um caminho alterado chave para mutações Transamidase+Remodelagem-Grupo específico (Fig. 3). Vários outros parceiros de sinalização dentro da via FGFR2 também estão associados a jangadas lipídicas, incluindo a FGF2 ligante e a FRS2 . Pode haver vários alvos ou interações com as vias de sinalização GPI-AP e FGFR2.
Representação esquemática da sinalização FGFR2 através da via Ras/Raf/MAPK. FGFR2 e B-Raf foram encontrados 2 associados a 15 dos 16 fenótipos sobre-representados no Grupo Transamidase+Remodelagem e estão em cascatas de sinalização associadas a jangadas lipídicas que contêm proteínas com âncoras GPI. *Números FGFs ativam o FGFR2. Apenas FGF2 é conhecido por estar associado a balsas lipídicas (roxas)
Interessantemente, duas proteínas-alvo, GPC3 e GPC6 estão associadas a 25 das anomalias fenotípicas associadas ao GPI-AP (Tabela 5). Ambas as proteínas são membros da família de proteoglicanos de sulfato de heparan que estão ligadas à superfície citoplasmática da membrana plasmática através de uma ligação GPI covalente. O GPC3 pode atuar como um coreceptor FGFR1 e FGFR2 necessário para a recepção e posterior relé dos sinais FGF9 responsáveis pelo controle do desenvolvimento vascular coronariano, sugerindo uma possível ligação.