A importância da fixação
Para estudar os tecidos com um microscópio eles devem ser preservados (fixos) e cortados em cortes suficientemente finos para serem translúcidos. A fixação é uma etapa crítica na preparação dos cortes histológicos. Se não for realizada em condições ideais ou se a fixação for retardada, uma amostra de tecido pode ser danificada irreversivelmente. Não importa quantos cuidados sejam tomados posteriormente no processamento, microtomia e coloração do tecido, a informação morfológica e histoquímica obtida da amostra será comprometida.
O objetivo geral da fixação tecidual é preservar células e componentes teciduais em “estado de vida” ou a menor alteração possível do tecido vivo, e fazer isso de forma a permitir a preparação de cortes finos e corados. A escolha do protocolo de fixação e do protocolo de fixação pode depender das etapas adicionais de processamento e das análises finais que são planejadas. Não existe um fixador perfeito, embora o formaldeído seja o que está mais próximo. Portanto, uma variedade de fixadores está disponível para uso, dependendo do tipo de tecido presente e das características a serem demonstradas.
Tipo de fixação
Fixação dos tecidos pode ser obtida por meios químicos ou físicos.
Métodos físicos incluem aquecimento, micro ondulação e criopreservação (secagem por congelamento).
A fixação química é geralmente conseguida através da imersão do espécime no fixador (fixação por imersão) ou, no caso de pequenos animais ou alguns órgãos inteiros como um pulmão, através da perfusão do sistema vascular com fixador (fixação por perfusão). Para alguns procedimentos histoquímicos especializados, os fixadores foram ocasionalmente aplicados sob a forma de vapor. Por exemplo, paraformaldeído e tetroxido de ósmio podem ser usados para fixar tecidos liofilizados a vapor.
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Mecanismo de fixação
Os dois principais mecanismos de fixação química são a reticulação e a coagulação.
Acoagulação envolve a formação de ligação covalente tanto dentro das proteínas como entre elas, o que causa a rigidez dos tecidos e portanto resiste à degradação.
Coagulação é causada pela desidratação de proteínas através do uso de álcoois ou acetona. Estes reagentes removem e substituem a água livre nas células e tecidos e causam uma mudança na estrutura terciária das proteínas através da ligação hidrofóbica desestabilizadora. Também é chamada desnaturação.
Factores que afectam a fixação
- Temperatura: Em geral, um aumento da temperatura aumentou a taxa de fixação, mas também aumentou a taxa de autólise e difusão de elementos celulares. Tradicionalmente, 0 a 4 °C tem sido considerada a temperatura ideal ou a fixação dos espécimes. Agora a fixação é rotineiramente realizada à temperatura ambiente.
- Tamanho: 1-4 mm de espessura
- Rácio volumétrico: Pelo menos 15-20 vezes maior que o volume do tecido
- Tempo: 24 – 48 horas
- pH: Deve ser mantido na faixa fisiológica, entre pH 4-9. O pH para a preservação da ultraestrutura deve ser tamponado entre 7,2 a 7,4.
Protocolos
- Métodos e protocolos para descalcificação de material ósseo
- Protocolo padrão para tecido embutido em parafina formal
Ligações úteis
- O processo de fixação e o Natureza dos Fixadores
- Soluções Fixativas Populares
- A Introdução Básica à Histologia
- Sociedade Nacional de Histotecnia
- A Introdução à Descalcificação
- Um Guia Prático de Boas Práticas de Histologia