Imunoensaios à Base de Tiras
Pontos-chave
- Simples de usar
- Resultados podem estar disponíveis em 15 minutos
- Baixo custo sem necessidade de equipamento adicional
- Estável e robusto no armazenamento
Embora os métodos rápidos tenham tido um grande impacto nos testes microbiológicos nos últimos vinte anos ou mais, apenas um punhado de empreendimentos pode alegar ter feito testes fora do laboratório. Um que pode, e está em uso generalizado como resultado, é o teste de imunoensaio de fluxo lateral, também conhecido como ensaio imunocromatográfico, ou teste de tira. Como muitas das melhores ideias, os imunoensaios de fluxo lateral utilizam tecnologia inteligente e sofisticada e a transformam em algo tão simples de operar que quase qualquer pessoa pode usá-la.
A tecnologia A tecnologia básica subjacente aos imunoensaios de fluxo lateral foi descrita pela primeira vez na década de 1960, mas a primeira aplicação comercial foi o teste de gravidez domiciliar Clearview da Unipath lançado em 1988. Desde então, a mesma tecnologia tem sido empregada para desenvolver uma ampla e crescente variedade de testes para aplicações clínicas, veterinárias, agrícolas, alimentícias, de bio-defesa e ambientais.
Testes de tiragem são extremamente versáteis e estão disponíveis para uma enorme variedade de analitos, de proteínas do sangue a micotoxinas e de patógenos virais a toxinas bacterianas. Foi mesmo desenvolvido um ensaio para os produtores de vinho para avaliar a quantidade de podridão Botrytis em uvas recém-colhidas.
Imunoensaios de fluxo lateral são essencialmente imunoensaios adaptados para operar ao longo de um único eixo para se adequar ao formato da tira de teste. Várias variações da tecnologia foram desenvolvidas em produtos comerciais, mas todos eles operam de acordo com o mesmo princípio básico.
Como funciona um ensaio imunocromatográfico de fluxo lateral?
Uma tira de teste típica consiste nos seguintes componentes:
- Almofada da amostra – uma almofada absorvente na qual a amostra é aplicada
- Almofada conjugada ou reagente – contém anticorpos específicos para o analito alvo conjugados a partículas coloridas (geralmente partículas de ouro coloidais, ou microesferas de látex)
- Membrana de reação – tipicamente uma membrana hidrofóbica de nitrocelulose ou acetato de celulose na qual os anticorpos do analito alvo são imobilizados em uma linha através da membrana como uma zona de captura ou linha de teste (uma zona de controle também pode estar presente, contendo anticorpos específicos para os anticorpos conjugados)
- Pentilha ou reservatório de resíduos – uma almofada absorvente adicional desenhada para retirar a amostra através da membrana de reacção por acção capilar e recolhê-la
Os componentes da tira são normalmente fixados a um material de suporte inerte e podem ser apresentados em formato de vareta simples ou dentro de um invólucro de plástico com uma porta de amostra e janela de reacção mostrando as zonas de captura e controlo.
Existem dois tipos principais de imunoensaio de fluxo lateral usados em testes microbiológicos:
Ensaio em sanduíche de anticorpos duplos Neste formato a amostra migra do bloco de amostras através do bloco conjugado onde qualquer analito alvo presente se ligará ao conjugado. A amostra então continua a migrar através da membrana até alcançar a zona de captura onde o complexo alvo/conjugado se ligará aos anticorpos imobilizados produzindo uma linha visível na membrana. A amostra então migra ainda mais ao longo da faixa até alcançar a zona de controle, onde o conjugado em excesso se ligará e produzirá uma segunda linha visível na membrana. Esta linha de controle indica que a amostra migrou através da membrana como pretendido. Duas linhas claras na membrana é um resultado positivo. Uma única linha na zona de controle é um resultado negativo. Os ensaios em sanduíche de anticorpos duplos são mais adequados para analitos maiores, tais como patógenos bacterianos e vírus, com múltiplos sítios antigénicos.
ensaios competitivos Os ensaios competitivos são usados principalmente para testar moléculas pequenas e diferem do formato de sanduíche de anticorpos duplos na medida em que o bloco conjugado contém anticorpos que já estão ligados ao analito alvo, ou a um análogo do mesmo. Se o analito alvo estiver presente na amostra, ele não se ligará ao conjugado e permanecerá sem rótulo. medida que a amostra migra ao longo da membrana e atinge a zona de captura, um excesso de substância a analisar não marcada ligar-se-á aos anticorpos imobilizados e bloqueará a captura do conjugado, de modo a que não seja produzida uma linha visível. O conjugado não ligado ligar-se-á então aos anticorpos na zona de controlo, produzindo uma linha de controlo visível. Uma única linha de controlo na membrana é um resultado positivo. Duas linhas visíveis nas zonas de captura e controle é um resultado negativo. Contudo, se não estiver presente um excesso de analito alvo não rotulado, pode ser produzida uma linha fraca na zona de captura, indicando um resultado inconclusivo. Ensaios competitivos são mais adequados para testes de moléculas pequenas, como micotoxinas, incapazes de se ligar a mais de um anticorpo simultaneamente. Há uma série de variações na tecnologia de fluxo lateral. A zona de captura na membrana pode conter antígenos imobilizados ou enzimas – dependendo do analito alvo – em vez de anticorpos. Também é possível aplicar múltiplas zonas de captura para criar um teste multiplex. Por exemplo, foram desenvolvidas tiras de teste comerciais capazes de detectar as toxinas EHEC Shiga ST1 e ST2 separadamente na mesma amostra.
Imunoensaios de fluxo lateral são simples de usar por operadores não treinados e geralmente produzem um resultado em 15 minutos. Eles são muito estáveis e robustos, têm uma longa vida útil e normalmente não requerem refrigeração. Também são relativamente baratos para produzir. Essas características os tornam ideais para uso no ponto de tratamento e para testar amostras no campo, bem como no laboratório. Entretanto, sua sensibilidade é limitada sem concentração adicional ou procedimentos de cultura.
Testes quantitativos Enquanto a maioria dos imunoensaios de fluxo lateral só são capazes de fornecer um resultado qualitativo, é possível obter algum grau de quantificação medindo a quantidade de conjugado ligado à zona de captura. Isto pode ser feito usando um leitor dedicado para medir a intensidade da linha de teste colorida. Por exemplo, a Neogen Corporation desenvolveu o leitor de fluxo lateral Accuscan™ para uso com sua linha de kits de ensaio Reveal® e a Charm Sciences também fornece um leitor para sua linha Rosa® de tiras de teste de micotoxinas. Também foram desenvolvidas técnicas mais sofisticadas, como tinturas conjugadas com rótulo fluorescente, para melhorar o potencial quantitativo dos ensaios de fluxo lateral. Aplicações Nos 20 anos desde o lançamento do primeiro teste de fluxo lateral, uma enorme variedade de testes diferentes foi desenvolvida com base na mesma tecnologia. Os primeiros kits disponíveis comercialmente eram destinados ao campo do diagnóstico clínico, mas agora existem produtos com aplicações em quase todos os ramos da microbiologia.
Microbiologia clínica – foram desenvolvidos testes de fluxo lateral para patógenos bacterianos, vírus respiratórios e entéricos, parasitas intestinais e toxinas bacterianas. Muitos dos produtos de imunoensaio de fluxo lateral concebidos para o sector clínico destinam-se a ser utilizados no ponto de tratamento para testes directos de amostras de fezes, sangue e urina e esfregaços de nariz e garganta, onde a simples operação e rapidez dos testes é a chave para a sua utilização fora do laboratório. No entanto, as mesmas tiras de teste também podem ser úteis como teste de confirmação rápida após cultura laboratorial de amostras clínicas.
Microbiologia alimentar e agrícola – as tiras de teste estão disponíveis para patógenos bacterianos de origem alimentar, toxinas bacterianas e fúngicas. No setor de microbiologia de alimentos, as principais aplicações são mais prováveis no laboratório, embora existam kits de teste de campo para micotoxinas em amostras de grãos. Os testes para patógenos bacterianos de origem alimentar geralmente envolvem pelo menos uma etapa de enriquecimento antes da tira de ensaio ser usada para confirmar a presença ou ausência do patógeno. Alguns fabricantes, como a Hygiena, desenvolveram meios e métodos de enriquecimento especificamente projetados para uso com tiras de teste de fluxo lateral. As tiras de teste também podem ser úteis para confirmação rápida da identidade dos isolados bacterianos dos testes microbiológicos convencionais.
Microbiologia da água e do ambiente – ensaios limitados disponíveis.
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