Ácidos Nucleicos
Como muitas moléculas biológicas, os ácidos nucleicos são polímeros, moléculas longas formadas de unidades repetidas. Com ácidos nucléicos, a unidade de repetição é o nucleotídeo. Um nucleotídeo consiste em um açúcar de carbono cinco, uma base contendo nitrogênio e um grupo de fosfato. Os dois tipos primários de ácidos nucléicos, ácido desoxirribonucleico (DNA) e ácido ribonucleico (RNA), possuem açúcares ligeiramente diferentes nos respectivos nucleotídeos e um conjunto diferente de quatro bases que podem ser contidos pelos nucleotídeos deles.
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| ADN Nucleotídeo | |
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| Núcleotide RNA | A estrutura de uma secção de uma molécula de RNA. |
Nota a presença de um grupo hidroxila no carbono de 2′ do moety do açúcar.
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| Adenina – DNA e RNA |
Guanina – DNA e RNA |
Himina –
DNA e RNA |
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| Citosina – DNA e RNA |
Uracil – RNA apenas |
De grande importância para a electroforese é a ionização dos grupos fosfato, dando aos ácidos nucleicos uma grande carga líquida negativa. Porque cada nucleotídeo é ionizado, a relação carga/massa de duas moléculas diferentes de ácido nucléico concordará muito de perto.
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| Os grupos de fosfato de cada nucleotídeo carregam uma carga formal negativa. Como cada nucleotídeo carrega a mesma carga, a relação carga/massa das diferentes moléculas de ácido nucléico é quase idêntica. A força elétrica faz com que as moléculas de ácido nucléico carregadas negativamente migrem para o pólo positivo. | |
DNA e RNA contêm quatro possíveis nucleotídeos correspondentes ao conjunto de quatro bases possíveis (adenina, guanina, timina e citosina para DNA; adenina, guanina, uracil, e citosina para RNA). Cada base exibe uma afinidade particular para uma das outras três bases, com base em simetrias de ligação de hidrogênio. A base de nitrogênio adenina “pares de bases” com a timina (ou uracilo no RNA). Os “pares de bases” adenina com citosina. Por causa do emparelhamento de bases, DNA ou RNA podem existir como variantes de cordão simples ou de cordão duplo. A forma de dupla cadeia consiste em duas cadeias complementares unidas por emparelhamento de base.
O emparelhamento de base de duas cadeias complementares permite que moléculas de ácido nucleico assumam uma forma de dupla cadeia.
O emparelhamento de base também pode ocorrer em DNA de cadeia simples ou RNA. Uma seção contendo uma seqüência de nucleotídeos irá freqüentemente fazer um loop back e um par de base com uma seção complementar na mesma cadeia. Isto irá afectar a estrutura tridimensional da molécula, com implicações nas separações electroforéticas. Em geral, fios longos de DNA ou RNA serão encontrados em uma conformação de base, seja fio duplo ou fio simples com emparelhamento interno. Ácidos nucleicos não emparelhados, ou “desnaturados”, só são encontrados em solução sob condições especiais que desestabilizam os pares de bases.
Acoplamento da base não se limita às variantes de duplo encalhamento, mas também pode ocorrer dentro da mesma molécula. As conformações resultantes podem levar a resultados de eletroforese que são difíceis de interpretar.
Electroforese de DNA ou RNA duplamente encalhado é referida como eletroforese em gel nativo. A eletroforese de DNA ou RNA de cadeia simples ocorre em condições de desnaturação. Formamida e uréia são os dois agentes mais comuns que realizam a desnaturação química. Estas substâncias agem para perturbar a ligação de hidrogênio entre as bases nitrogenadas, removendo assim os efeitos do emparelhamento de bases. Normalmente, alguma combinação de formameto, uréia e calor é empregada durante o processo de desnaturação eletroforese desde o preparo da amostra até o funcionamento do gel. Os objetivos da desnaturação são assegurar moléculas isoladas e prevenir mudanças conformacionais devido ao emparelhamento de bases entre diferentes seções da mesma molécula de DNA ou RNA. As condições de eletroforese de desnaturação permitem uma relação consistente entre tamanho molecular e mobilidade através do gel.
Formamida e uréia realizam a desnaturação do DNA ou RNA através da formação de novas ligações de hidrogênio com as bases das moléculas de ácido nucléico, rompendo as ligações de hidrogênio que levam ao emparelhamento de bases.
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