Descoberta de um novo caminho governado pela proteína de sinalização Notch abre portas para um melhor desenvolvimento de drogas
Por Lindsay Brownell
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(BOSTON) – A cada minuto, um galão e meio de pulsos de sangue através da rede de veias e artérias do corpo. A força desse fluxo sanguíneo ajuda a manter saudáveis as células que revestem os vasos sanguíneos, chamadas células endoteliais; quando o fluxo sanguíneo é interrompido, como durante procedimentos cirúrgicos ou um acidente vascular cerebral, os vasos começam a vazar, o que pode causar uma série de respostas inflamatórias que levam a danos celulares e doenças. Os cientistas do Instituto Wyss da Universidade de Harvard resolveram o mistério de como o fluxo sanguíneo mantém os vasos intactos e, para sua surpresa, descobriram um caminho de sinalização celular completamente novo que é um alvo promissor para os medicamentos para tratar uma variedade de condições debilitantes.
“Descobrimos que a conhecida proteína Notch é responsável por impedir que os vasos sanguíneos vazem, e o faz através de uma via de sinalização secundária que opera de uma maneira completamente diferente da sua conhecida via baseada em transcrição”, diz Chris Chen, M.D., Ph.D., membro da Faculdade Associada do Instituto Wyss e Diretor Fundador do Centro de Design Biológico e Professor Distinto de Engenharia Biomédica da Universidade de Boston, que é o autor correspondente do trabalho. “Este novo caminho não só é excitante do ponto de vista da descoberta, como pode amenizar alguns dos efeitos secundários do cancro e dos medicamentos cardiovasculares, tornando-os mais seguros e eficazes”. O estudo está publicado hoje na Nature.
As células endoteliais que revestem os vasos sanguíneos estão fortemente ligadas entre si através de ligações chamadas junções aderentes para formar uma barreira que mantém o sangue dentro do vaso e regula a facilidade com que outras substâncias podem passar para dentro e para fora dele. Para estudar essa barreira e determinar por que a falta de fluxo sanguíneo causa seu vazamento, os pesquisadores construíram um modelo de vaso sanguíneo em um chip que consiste em um canal revestido por uma camada de células endoteliais humanas envolvidas por uma matriz extracelular dentro de um dispositivo microfluídico, o que lhes permitiu simular e controlar facilmente o fluxo de sangue através de um vaso e avaliar as respostas das células.
Células endoteliais que apresentaram fluxo sanguíneo apresentaram aumento da atividade da proteína transmembrana Notch1, enquanto as células expostas ao sangue estático não apresentaram. Quando os pesquisadores adicionaram um químico que bloqueia a ativação do Notch1, impedindo que seu domínio intracelular se desprenda, observaram que o vaso começou a vazar, o que determinaram ser causado pela ruptura das junções aderentes entre as células endoteliais vizinhas e a reorganização das fibras de actina dentro de cada célula. Isto confirmou que a ativação do Notch1 pelo fluxo sanguíneo é necessária para a formação e manutenção da barreira endotelial dos vasos sanguíneos.
Curiamente, evitando que o domínio intracelular do Notch1 iniciasse a transcrição após o descolamento (que é o mecanismo de ação bem estabelecido do Notch1) não fazia com que os vasos vazassem, o que implicava que alguma outra parte da proteína cuja função não envolvia transcrição estava respondendo ao fluxo sanguíneo. Esta suspeita foi reforçada por experiências in vivo em que os cientistas injectaram ratos com um químico que bloqueou o Notch1 juntamente com um corante azul, e viram que o corante vazou para fora dos vasos sanguíneos dos ratos tratados a um ritmo muito mais rápido do que o esperado. “Transcrever um gene em uma proteína que depois desempenha alguma função dentro da célula geralmente leva cerca de duas horas, mas estávamos vendo vazamento em 30 minutos, sugerindo ainda que qualquer processo que controle a permeabilidade da barreira está operando através de um mecanismo completamente diferente”, diz Bill Polacheck, Ph.D., Pós-doutorado no Instituto Wyss e co-autor do artigo.
Após terem estabelecido que o domínio intracelular não estava envolvido na regulação da barreira endotelial, os cientistas examinaram outras partes da Notch1 para actividade. Eles usaram CRISPR/Cas-9 para deletar várias seções do gene Notch1, e descobriram que deletar a seção que codifica o domínio intracelular não tinha efeito sobre a permeabilidade, enquanto que deletar a minúscula seção do domínio transmembrana (TMD) também fez com que o vazamento do vaso aumentasse em condições de fluxo. “Esta é a primeira vez que a função biológica da TMD Notch foi avaliada”, diz Matthew Kutys, Ph.D., um Visit Fellow do Wyss Institute e co-autor. “Foi em grande parte assumido como inerte e simplesmente desapareceu após a ativação, e a maioria dos livros didáticos e artigos de pesquisa nem sequer a mostram como uma porção distinta dos receptores da Notch”. Através de mais testes, eles descobriram que quando o Notch1 é ativado e seu domínio intracelular é liberado, sua DTM monta um complexo na membrana com as proteínas VE-cadherina, Rac1, LAR e Trio, que coletivamente montam e mantêm as junções aderentes entre as células e distribuem fibras de actina contra a membrana celular para suportar essas junções.
“Em retrospectiva, lançamos os dados com este projeto, pois ao optar por investigar o Notch estávamos entrando numa das áreas de pesquisa mais lotadas em biologia. Mas nossa abordagem baseada em engenharia nos permitiu estudá-la de uma nova maneira, sem a influência ou o preconceito do trabalho passado, que eu acho que foi o que nos fez ter a mente aberta o suficiente para observar e caracterizar este novo e inesperado caminho”, diz Polacheck. “Saber que Notch1 regula a adesão celular além da diferenciação celular também oferece uma nova estrutura para entender a coordenação de processos celulares complexos, em que moléculas únicas como Notch podem desempenhar múltiplos papéis”, acrescenta Kutys.
A revelação de que Notch1 serve a diferentes funções, e saber quais partes da proteína governam cada função, permite o desenvolvimento de novas drogas que são tanto mais eficazes quanto menos tóxicas”. “O Notch é um alvo para algumas terapias do câncer, mas sabe-se que esses medicamentos causam edema e outros problemas. Agora, estamos trabalhando ativamente na separação dos dois caminhos da Notch para que possamos criar medicamentos que visem apenas o domínio intracelular, poupando a DTM e preservando assim a integridade dos vasos sanguíneos”, diz Karen Hirschi, Ph.D., professora de Medicina e Genética da Escola de Medicina de Yale, que colaborou no estudo. Sabendo que a Notch governa a permeabilidade dos vasos sanguíneos faz dela uma candidata a novos medicamentos para tratar doenças cardiovasculares também, e a equipe também está investigando a DTM como um agente terapêutico em potencial, já que modelos celulares que foram expostos a inflamações causadoras de vazamento mostraram uma redução dramática no vazamento quando foram projetados para expressar a DTM.
“As colaborações que o Instituto Wyss possibilita e nutre entre campos díspares, como a engenharia mecânica e a biologia molecular, fomentam novas abordagens para problemas antigos que podem levar a resultados verdadeiramente mutáveis”, diz Donald Ingber, M.D. Ph.D, diretor fundador do Instituto Wyss e professor de Biologia Vascular do Judah Folkman na Harvard Medical School e do Programa de Biologia Vascular no Boston Children’s Hospital, que também é professor de Bioengenharia na Harvard Paulson School of Engineering and Applied Sciences (SEAS). “Este estudo é um excelente exemplo dos benefícios que estes tipos de parcerias podem proporcionar à ciência e à sociedade”
Os autores adicionais do estudo incluem Jinling Yang, Ph.D., Pós-Doutorado no Wyss Institute; Jeroen Eyckmans, Ph.D., ex-Wyss Postdoctral Fellow e atual líder de grupo da Universidade de Boston; Yinyu Wu, estudante de pós-graduação no Departamento de Genética de Yale; e Hema Vasavada, gerente de laboratório da Escola de Medicina de Yale.
Esta pesquisa foi apoiada por bolsas dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH), da Fundação Nacional de Ciência (NSF), de um Prêmio Ruth L. Kirchstein National Research Service, da Fundação Hartwell, e do Instituto Wyss da Universidade de Harvard.
- PUBLICAÇÃO – Natureza: Um complexo de Notch não canônico regula as junções aderentes e a função da barreira vascular