Braz J Med Biol Res, Outubro de 2003, Volume 36(10) 1447-1454
O gene 5alfa redutase tipo 1, mas não tipo 2, é expresso em pêlos anágenos arrancados da área do vértice do couro cabeludo de mulheres hirsute e indivíduos normais
I.O. Oliveira1,2, C. Lhullier1, I.S. Brum1 e P.M. Spritzer1,3
1Departamento de Fisiologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil
2Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS, Brasil
3Unidade de Endocrinologia Ginecológica, Serviço de Endocrinologia, Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Porto Alegre, RS, Brasil
Resumo
Resumo 
O objectivo deste estudo foi determinar a expressão dos genes para o tipo 1 (SDR5A1) e tipo 2 (SDR5A2) 5a-reductase isoenzymes em cabelos do couro cabeludo depenados de 33 pacientes hirsute (20 com síndrome do ovário policístico e 13 com hirsutismo idiopático) e compará-lo com o de 10 homens e 15 mulheres normais. A expressão SDR5A1 e SDR5A2 foi estimada por RT-PCR usando o gene da proteína ß2-microglobulina expressa ubíquamente como um controle interno. Os resultados são expressos como unidades arbitrárias em relação à absorção de ß2-microglobulina (média ± SEM). A expressão SDR5A2 não foi detectada em nenhuma amostra de cabelo analisada no presente estudo. Não foram encontradas diferenças nos níveis de mRNA do SDR5A1 entre homens e mulheres normais (0,78 ± 0,05 vs 0,74 ± 0,06, respectivamente). A expressão do gene SDR5A1 nas células de cabelos arrancados do couro cabeludo de mulheres normais (0,85 ± 0,04) e de mulheres com síndrome do ovário policístico (0,78 ± 0,05) e hirsutismo idiopático (0,80 ± 0,06) também foi semelhante. Estes resultados indicam que a expressão do gene SDR5A1 nos queratinócitos foliculares da área do vértice do couro cabeludo parece não estar relacionada com as diferenças de crescimento capilar observadas entre homens e mulheres normais e pacientes hirsutistas. Estudos adicionais são necessários para investigar a expressão dos genes 5a-reductase em outros compartimentos foliculares do couro cabeludo, como papilas dérmicas, e também em folículos pilosos de outros locais do corpo, a fim de elucidar o mecanismo de ação dos andrógenos no processo de crescimento capilar e doenças relacionadas.
Palavras-chave: Folículo piloso, Hirsutismo, 5a-Redutase, Síndrome dos ovários policísticos
Introdução
Andrógenos são os principais reguladores do crescimento do cabelo humano e estão associados a uma das principais doenças clínicas de crescimento capilar, nomeadamente o hirsutismo. Esta condição corresponde ao crescimento excessivo do pêlo corporal em mulheres com um padrão masculino de distribuição do pêlo corporal. A presença de hirsutismo pode sinalizar condições associadas ao aumento da secreção androgênica pelos ovários e/ou adrenais como a síndrome dos ovários policísticos (PCOS), tumores androgênicos secretores e hiperplasia adrenal não-clássica ou pode resultar de hipersensibilidade periférica aos andrógenos circulantes (hirsutismo idiopático, IH) (1-3). Embora em geral esta condição não seja uma ameaça à vida, é muito angustiante para os pacientes e tem um impacto psicossocial negativo significativo. A investigação dos efeitos dos andrógenos no crescimento do cabelo na presença do hirsutismo deve melhorar o nosso conhecimento da biologia do folículo piloso humano.
O efeito de todos os andrógenos activos nas células alvo é mediado pela sua ligação ao mesmo receptor nuclear de andrógenos. Estudos anteriores sobre as síndromes de resistência aos andrógenos revelaram a importância do receptor de andrógenos para o crescimento do cabelo dependente de andrógenos (4-6). Mais recentemente, observou-se um aumento da capacidade de ligação dos andrógenos às células capilares do couro cabeludo de homens calvos (7). Entretanto, não foi encontrada até o momento nenhuma diferença consistente no número ou função do receptor de androgênio em pacientes hirsute em comparação com indivíduos normais (8,9).
Os folículos pilosos têm controle autônomo sobre o metabolismo dos andrógenos, ajustando a produção e degradação dos hormônios andrógenos de acordo com as necessidades locais (10). Em condições normais, a 5a-reductase tem um papel fundamental na acção dos andrógenos nos folículos capilares, convertendo a testosterona para a mais potente dihidrotestosterona androgénica (11,12). Estudos de clonagem molecular caracterizaram dois genes que codificam as isoenzimas de 5a-reductase tipo 1 e tipo 2 (13,14). A isoenzima 5a-reductase predominante na pele é do tipo 1 (SDR5A1) (15), que tem 60% de homologia com 5a-reductase tipo 2 (SDR5A2), característica da glândula prostática (14). Foi demonstrado um aumento na atividade 5a-reductase em fibroblastos de pele genital e púbica de pacientes hirsute em comparação com a pele de mulheres normais (8,16). Estes estudos relataram um aumento na atividade 5a-reductase mesmo em IH, que é caracterizada pela ausência de níveis elevados de androgênio plasmático (17). Além disso, a pele púbica de pacientes hirsute expressa a mesma isoforma SDR5A1 que a pele púbica de indivíduos normais, enquanto a SDR5A2 é expressa principalmente na pele genital tanto de indivíduos normais como de pacientes hirsute (18). Entretanto, o papel fisiológico das isoenzimas 5a-reductase não é completamente compreendido e sua distribuição em diferentes compartimentos cutâneos ainda não está clara. Alguns estudos imunohistoquímicos e de atividade enzimática sugeriram uma expressão predominante da enzima SDR5A1 em glândulas sebáceas, mas também em glândulas sudoríparas, células epidérmicas, bainha radicular e células papilares dérmicas dos folículos pilosos (19-21), enquanto a SDR5A2 só é expressa nesses compartimentos em níveis muito baixos. Em contraste, outros estudos demonstraram uma distribuição diferente destas isoenzimas dentro da unidade pilossebácea (22-24). Parece haver uma maior distribuição de SDR5A1 nos compartimentos foliculares do cabelo em comparação com SDR5A2. Além disso, como os queratinócitos das bainhas radiculares apresentam alta expressão do gene SDR5A1, provavelmente desempenham um papel importante no metabolismo androgênico dos folículos pilosos.
O objetivo deste estudo foi avaliar a expressão dos genes SDR5A1 e SDR5A2 nas células das bainhas radiculares da área do vértice do couro cabeludo de pacientes hirsute e compará-la com indivíduos normais de ambos os sexos.
Pacientes e Métodos >
Sujeitos
A população do estudo incluiu mulheres consultoras para hirsutismo observadas consecutivamente durante um período de 6 meses na Unidade de Endocrinologia Ginecológica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Brasil. Trinta e três pacientes com idade entre 12 e 42 anos foram selecionados para o estudo. Vinte pacientes foram diagnosticados como tendo PCOS e 13 como tendo IH. O diagnóstico de PCOS foi baseado nas características físicas do hiperandrogenismo, ciclos menstruais perturbados, níveis elevados de hormônio luteinizante sérico (LH) ou relação LH/hormônio estimulante do folículo, aumento dos níveis de testosterona total e/ou índice de androgênio livre (FAI), evidência ultra-sonográfica de ovários policísticos bilaterais aumentados (25,26) e ausência de neoplasia ovariana ou adrenal ou síndrome de Cushing. O IH foi diagnosticado como descrito anteriormente (27) em pacientes hirsutistas com ciclos ovulatórios regulares (níveis de progesterona na fase luteal superiores a 3,8 ng/ml), níveis normais de androgênio, e sem nenhuma doença subjacente conhecida.
Pacientes com hiperplasia adrenal congênita tardia (não-clássica) não foram considerados para o estudo com base em um alto nível plasmático de 17-hidroxiprogesterona (>5 ng/ml) e/ou seu acentuado aumento após estimulação do ACTH (>12 ng/ml) (28,29). Pacientes com hiperprolactinemia (níveis séricos de prolactina superiores a 20 µg/l em duas ocasiões diferentes) também foram excluídos.
Quinze mulheres normais com ciclos menstruais regulares de 16-37 anos e dez homens de 16-29 anos também foram selecionados para o estudo, que foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Foi obtido o consentimento livre e esclarecido de cada sujeito. Nenhum dos sujeitos havia recebido nenhum medicamento conhecido que interferisse com os níveis séricos de androgênio, estrogênio ou gonadotropina por pelo menos 3 meses antes do estudo.
níveis de mRNA SDR5A1 e SDR5A2 foram estimados pela reação em cadeia de transcrição-polimerase reversa (RT-PCR) em células capilares arrancadas da porção do vértice do couro cabeludo de homens normais, mulheres normais e pacientes hirsutistas.
Protocolo de estudo
Medidas antropométricas incluíram peso corporal, altura e índice de massa corporal (IMC = peso atual medido em kg dividido pela altura em m2). O escore de hirsutismo foi classificado pelo método Ferriman-Gallwey (30), excluindo as áreas da perna inferior e antebraço.
A avaliação hormonal foi realizada entre o 2º e 10º dia do ciclo menstrual ou em qualquer dia quando os pacientes estavam amenorréicos. Após um jejum noturno, foram retiradas amostras de sangue de uma veia antecubital para determinação de LH, globulina aglutinante do hormônio sexual (SHBG) e testosterona total. Todas as amostras foram obtidas entre as 8 e as 10 da manhã. A FAI foi estimada dividindo a testosterona total (nmol/l) por SHBG (nmol/l) x 100,
Ensaios
A testosterona total foi medida por radioimunoensaio de duplo anticorpo (ICN, Costa Mesa, CA, EUA), com um limite de detecção de ensaio de 0.04 ng/ml e coeficiente de variância (CV) intra e interensaio de 10 e 15%, respectivamente; o SHBG foi medido por um ensaio imunochemiluminométrico (ICMA; DPC, Los Angeles, CA, EUA), com limite de detecção de 0,2 nmol/l, e CV intra e interensaio de 5,0 e 8,0%, respectivamente. LH foi medido pelo ICMA, com um limite de detecção de 0,7 mIU/ml e CV intra e interensaio de 5,2 e 8,0%, respectivamente.
protocolo RT-PCR
pêlos de anágeno depenados foram coletados do vértice do couro cabeludo de todos os sujeitos e imediatamente congelados em nitrogênio líquido e transportados para o laboratório para os ensaios. A extração do RNA total e a síntese do cDNA foram realizadas conforme descrito anteriormente (31). As raízes capilares depenadas foram homogeneizadas em isotiocianato de fenol-guanidina (Trizol, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, EUA). O RNA total foi extraído com clorofórmio e precipitado com isopropanol por 12.000 g de centrifugação a 4ºC. O RNA pellet foi lavado duas vezes com etanol a 75%, ressuspenso em água tratada com diethylpyrocarbonate e quantificado por absorção a 260 nm.
O cDNA do primeiro fio foi sintetizado a partir de 5 µg de RNA total para todas as reações utilizando o Sistema de Pré-amplificação SuperScript (Gibco-BRL). Após desnaturar o RNA do molde e os primers a 70ºC durante 10 min, foi adicionada transcriptase reversa na presença de 20 mM Tris-HCl, pH 8,4, mais 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 0,5 mM dNTP mix e 10 mM dithiothreitol, e incubada a 42ºC durante 55 min. A mistura foi aquecida a 70ºC para parar a reação e então incubada com E. coli RNase por 20 min a 37ºC para destruir o RNA não transcrito. O modelo (cDNA) utilizado nos diferentes ensaios de PCR foi obtido a partir da mesma reacção de transcrição inversa. A PCR foi realizada em um volume final de 50 µl. Dois microlitros da primeira reacção de síntese do cordão (com um rendimento esperado de cDNA de 10 ng) foram desnaturados a 94ºC durante 3 min (2 min apenas para ß2-microglobulina) na presença de 20 mM Tris-HCl, pH 8,4, mais 50 mM KCl e 1,5 mM MgCl2. Após este início quente, 1,25 U de Taq DNA polimerase foi adicionado junto com o mesmo tampão Tris-HCl, 1,5 mM MgCl2, 0,4 µM de sentido e primers antisense e 0,2 mM de mistura dNTP.
Um fragmento de 368-bp do SDR5A1 (24) e um fragmento de 566-bp do SDR5A2 (14) cDNA foram amplificados usando iniciadores desenhados para atravessar fronteiras intron-exon de forma a prevenir a amplificação de qualquer DNA genómico contaminante. Um fragmento de cDNA 623-bp correspondente à proteína ß2-microglobulina (32) expressa ubíquamente foi amplificado para normalizar as quantidades de cDNA em cada amostra. As seqüências de cDNA de SDR5A1 e SDR5A2 e primers de ß2-microglobulina estão listadas na Tabela 1. A PCR foi padronizada testando um número de ciclos (20 a 45) e a amplificação foi realizada na faixa linear. As condições finais da PCR foram as seguintes: 35 ciclos (45 s a 94ºC, 45 s a 60ºC, 90 s a 72ºC, 10 min a 72ºC) para SDR5A1, 40 ciclos (1 min a 94ºC, 1 min a 65ºC, 2 min a 72ºC, 5 min a 72ºC) para SDR5A2, e 30 ciclos (1 min a 94ºC, 1 min a 55ºC, 1 min a 72ºC, 5 min a 72ºC) para ß2-microglobulina. O cDNA a partir de células dissociadas da glândula prostática humana foi utilizado como controlo positivo para todas as reacções PCR. Não foi adicionado cDNA às reacções negativas. Uma amostra da mistura de PCR (15 µl) foi fracionada em gel de agarose 1,5-2,0% corada com brometo de etídeo, administrada a 100 V e visualizada sob luz UV. As bandas esperadas foram quantificadas por análise densitométrica usando um sistema de processamento de imagem (ImageMaster VDS, Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia).
Análise estatística
Os dados são relatados como média ± SEM, a menos que seja observado o contrário. As médias dos grupos foram comparadas pelo teste t de Student ou pela análise de variância unidirecional (ANOVA) seguida pelo teste de Duncan, e os valores medianos foram comparados pelo teste de Mann-Whitney. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas em P < 0,05. Todas as análises foram realizadas utilizando os Pacotes Estatísticos para as Ciências Sociais (SPSS, Inc., Chicago, IL, EUA).
Resultados
Tabela 2 resume os dados antropométricos e hormonais para pacientes com PCOS e IH. Não foram observadas diferenças significativas entre os dois grupos de pacientes hirsute em relação à idade ou escore clínico para hirsutismo. Entretanto, os pacientes hirsutistas com PCOS apresentaram IMC mais alto e apresentaram níveis significativamente mais altos de testosterona, FAI e LH do que o grupo IH. As concentrações de SHBG foram menores no grupo PCOS do que no grupo IH.
A expressão do gene SDR5A2 não foi detectada em nenhuma amostra de cabelo do couro cabeludo analisada por RT-PCR no presente estudo (Figura 1).
A Figura 2 mostra os níveis de mRNA do SDR5A1 em células capilares arrancadas do couro cabeludo de indivíduos normais. A expressão SDR5A1, apresentada como unidades arbitrárias em relação à absorção de ß2-microglobulina, foi semelhante nos homens (0,78 ± 0,05) e nas mulheres normais (0,74 ± 0,06). Além disso, não foram observadas diferenças significativas na expressão dos queratinócitos foliculares de DRS5A1 entre mulheres normais (0,85 ± 0,04) e os grupos hirsute PCOS (0,78 ± 0,04) ou IH (0,80 ± 0,06) (Figura 3).
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Figura 1. Gel representativo de agarose corado com brometo de etídeo, sem expressão de SDR5A2 mRNA por RT-PCR em células capilares arrancadas do couro cabeludo de homens (1 a 9), mulheres normais (10 a 17) e pacientes hirsutistas: grupo PCOS (18 a 31) e grupo IH (32 a 39). O fragmento 566-bp corresponde a SDR5A2 (5a-R2) e o fragmento 623-bp corresponde a ß2-microglobulina (ß2-m). A amplificação SDR5A2 foi visualizada apenas em células prostáticas dissociadas usadas como controle positivo (+). |
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Figura 2. Gel representativo mostrando níveis de mRNA SDR5A1 determinados por RT-PCR em células capilares arrancadas do couro cabeludo de homens (1 a 7) e mulheres normais (8 a 14). O fragmento 368-bp corresponde a SDR5A1 (5a-R1) e o fragmento 623-bp corresponde a ß2-microglobulina (ß2-m). Os produtos RT-PCR foram visualizados em gel de agarose corado com brometo de etídeo. + = controle positivo. |
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Figura 3. Gel representativo mostrando níveis de mRNA SDR5A1 determinados por RT-PCR em células capilares arrancadas do couro cabeludo de mulheres normais (1 a 14) e de ambos os grupos de pacientes hirsute (PCOS: 15 a 26; IH: 27 a 35). O fragmento 368-bp corresponde a SDR5A1 (5a-R1), e o fragmento 623-bp corresponde a ß2-microglobulina (ß2-m). Os produtos RT-PCR foram visualizados em gel de agarose corado com brometo de etídio. |
Discussão
Embora a atividade da 5a-reductase cutânea esteja associada ao hirsutismo, o papel específico e a identificação da isoenzima envolvida nesta condição clínica de crescimento capilar ainda precisam ser melhor definidos. No presente estudo, investigamos a expressão do mRNA de ambos os tipos de 5a-reductase em células capilares depenadas do couro cabeludo anágeno de pacientes hirsute.
O gene SDR5A1 foi expresso em células capilares depenadas obtidas a partir do vértice do couro cabeludo de indivíduos normais. Outros estudos demonstraram resultados semelhantes, mesmo quando o mRNA do SDR5A1 foi investigado em queratinócitos foliculares em cultura (24,33). Os pêlos de anágeno depenados são constituídos principalmente por células queratinócitas formando tanto as bainhas radiculares externas quanto internas. A bainha do tecido conjuntivo, o bulbo inferior, as células da papila dérmica e a glândula sebácea estão ausentes nos pêlos depenados. Portanto, nossos dados confirmam a expressão gênica do SDR5A1 em queratinócitos foliculares, e estão de acordo com outros, que mostraram imunoreatividade 5a-reductase nas células da bainha radicular dos folículos pilosos (20,23).
No presente estudo, os níveis de mRNA do SDR5A1 em cabelos depenados do couro cabeludo não diferiram entre homens e mulheres normais. Estudos anteriores também descreveram uma atividade similar de 5a-reductase nos folículos pilosos de homens e mulheres (12,34). Em contraste, uma maior atividade de 5a-reductase em amostras de pele púbica foi detectada em homens normais do que em mulheres normais (1). Em conjunto, estes resultados sugerem que em indivíduos normais a regulação da 5a-reductase parece diferir entre queratinócitos foliculares do couro cabeludo e fibroblastos da pele púbica.
As células foliculares do couro cabeludo parecem não ser o principal alvo do hirsutismo. No entanto, existem algumas dificuldades éticas na obtenção de amostras da face dos pacientes hirsutistas. Além disso, existem poucos relatos na literatura sobre os mecanismos moleculares das células foliculares capilares do couro cabeludo na presença de hirsutismo (9). A região do couro cabeludo é um local bem conhecido e sensível ao androgênio em ambos os sexos e é relativamente fácil obter uma amostra de pêlos do couro cabeludo. Portanto, é interessante investigar alguns aspectos do metabolismo dos andrógenos nas células capilares arrancadas do couro cabeludo, particularmente quando é possível comparar sujeitos com uma exposição endógena a níveis mais elevados (PCOS) ou normais (IH) de andrógenos circulantes.
Não observamos diferenças nos níveis de mRNA do SDR5A1 nos queratinócitos foliculares entre pacientes hirsute e mulheres normais ou entre homens e mulheres normais. Além disso, pacientes com altos níveis séricos de androgênio (grupo PCOS) apresentaram a mesma expressão gênica de SDR5A1 que aqueles com IH e níveis normais de androgênio. Enquanto SDR5A1 é a isoenzima predominante na pele (14), os resultados atuais indicam que os andrógenos circulantes provavelmente não contribuem para a expressão do gene SDR5A1 nos queratinócitos foliculares do couro cabeludo, sugerindo que SDR5A1 não é a isoenzima chave no metabolismo local dos andrógenos da pele do couro cabeludo. Por outro lado, a eficácia do inibidor de 5a-reductase finasterida no tratamento da queda de cabelo padrão masculino (35), bem como no IH, foi demonstrada (36,37). A finasterida é um inibidor oralmente ativo que bloqueia preferencialmente a 5a-reductase tipo 2, mas também pode inibir a isoenzima tipo 1, causando uma queda acentuada nos níveis de dihidrotestosterona e glucuronida 3a-androstenediol. Não tem afinidade com o receptor androgênico nem efeitos androgênicos, estrogênicos, progestacionais ou outros efeitos esteroidais (38). Em concordância com nossos resultados, estes estudos indicaram que a 5a-reductase tipo 2 provavelmente tem um papel mais crítico no processo de crescimento capilar e condições clínicas relacionadas.
Os resultados atuais mostram que o gene SDR5A2 não foi expresso nos queratinócitos foliculares de nenhum sujeito, homem ou mulher normal ou paciente hirsuto. Estudos anteriores descreveram a localização preferencial do mRNA SDR5A2 e da atividade enzimática (39,40) nas células da papila dérmica, embora a imunoreatividade do SDR5A2 também tenha sido encontrada nos queratinócitos do folículo piloso (20,22). As aparentes discrepâncias na expressão das proteínas entre estes estudos podem ser explicadas, pelo menos em parte, pelos diferentes métodos de análise imunohistoquímica dos dados qualitativos. Quanto à ausência de expressão gênica de SDR5A2, descrita no presente estudo, métodos mais sensíveis de análise de expressão gênica, por exemplo, PCR em tempo real, possivelmente esclarecerão esta questão no futuro.
Não investigamos a expressão gênica de isoenzimas 5a-reductase em outros compartimentos foliculares como papilas dérmicas, pois estas células não estão presentes em pêlos depenados isolados. As células da papila dérmica são obtidas apenas por biópsia de excisão, que é um método invasivo e estressante. No entanto, será muito interessante investigar isoenzimas de 5a-reductase nas células da papila dérmica de pacientes hirsute, uma vez que foi sugerido que estas células podem ser o alvo direto de andrógenos nos folículos pilosos, regulando a atividade da matriz capilar, melanócitos e queratinócitos com sinais parácrinos (10).
expressão do gene SDR5A1 nos queratinócitos foliculares da área do vértice do couro cabeludo parece não estar relacionado às diferenças de crescimento capilar observadas entre homens e mulheres normais e pacientes hirsutistas. Mais investigações sobre a regulação da expressão do gene 5a-reductase nas células do folículo piloso em diferentes locais do corpo podem ajudar a elucidar o intrigante mecanismo de ação androgênica no processo de crescimento capilar e doenças associadas.
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