Proteínas Fluorescentes de A. victoria
Proteínas espectrais de GFP ou suas variantes encontram-se na estrutura de aminoácidos que formam o cromóforo (Figura 1). Estes podem ser os três aminoácidos nas posições 65-67 ou resíduos próximos a este local (por exemplo, YFP). Além das principais mutações relativas ao cromóforo, também foram realizadas pesquisas sobre a mutagênese em outros locais para melhorar outros fatores como maturação e expressão de proteínas em sistemas celulares heterólogos (por exemplo, uso de códon, dobramento de proteínas à temperatura fisiológica). Note que A. victoria é um organismo marinho relativamente primitivo sem sistema de calor corporal.
Even se a GFP é uma das FPs mais populares devido ao seu brilho e alta fotoestabilidade, ela tem duas desvantagens principais. Estas são uma certa sensibilidade ao pH e uma ligeira tendência para a dimerização. A dimerização ou oligomerização é um problema de muitos FPs. Sua preferência por aglutinar entre si pode produzir artefatos ou interpretações errôneas sobre a localização e função da proteína fundida. Mas os cientistas também encontraram algumas respostas para esse problema. Mutações em posições críticas (F223R, L221K e A206K) onde aminoácidos não-polares são substituídos por hidrofílicos mostram dimerização reduzida. Todas as alterações genéticas que levam a uma melhoria das características espectrais e práticas são resumidas sob o nome de FPs “melhoradas”.
No caso do wtGFP, as melhorias levam a um EGFP (enhanced GFP) com um único pico de excitação a 488 nm em vez do anterior espectro de absorção complexo a 395 nm e 475 nm. A primeira versão mutante do wtGFP (o mutante S65T) desenvolvido por Roger Tsien et al. foi cinco vezes mais brilhante do que o original e mostrou um tempo de maturação mais curto. Juntamente com uma melhor eficiência de maturação a 37°C, baseada em outra mutação (F64L), isto desempenha um papel importante para pessoas que olham para células vivas.
Uma variante GFP muito interessante com um dos maiores turnos de Stokes é o Sapphire. Uma mutação em uma posição próxima ao cromóforo (T203I) leva a uma alteração da excitação máxima para 399 nm e a emissão máxima para 511 nm. Este é um turno de Stokes de 112 nm. A esmeralda é outra modificação da GFP com melhor fotoestabilidade e brilho e dobra mais eficiente em células de mamíferos.
Enquanto todas as proteínas fluorescentes verdes têm um brilho relativamente alto, as proteínas fluorescentes azuis normalmente sofrem de intensidade de emissão reduzida em aplicações microscópicas. No entanto, são utilizadas em ensaios ópticos devido a outras propriedades espectrais. A EBFP (Enhanced Blue Fluorescent Protein) foi construída por várias rodadas de wtGFP mutantes. A primeira (Y66H) saltou o pico de emissão do espectro verde para o azul. Seguiram-se mais mutações, produzindo uma proteína com uma excitação máxima a 380 nm e uma emissão máxima a 448 nm. Estas propriedades espectrais fazem dela um parceiro para o EGFP em microscopia FRET. As recentes proteínas fluorescentes azuis com maiores rendimentos quânticos e melhor fotoestabilidade são Azurite, SBFP2 e EBFP2. Um sucessor promissor do EBFP é uma proteína chamada Sirius que se tornou popular devido à sua alta tolerância ao pH (estável de pH 3-9) e sua reputação de ser a proteína fluorescente com o menor comprimento de onda de emissão até hoje.
Uma segunda classe “azul” de variantes GFP é formada por proteínas fluorescentes ciano: CFPs. A substituição da tirosina pelo triptofano (Y66W) e outras alterações genéticas levam a um fluorocromo com melhor brilho e fotoestabilidade. Este ECFP tem um espectro de excitação e emissão bimodal a 433/445 nm e 475/503 nm. A luminosidade é apenas cerca de 40% da do EGFP. Uma variante proeminente do ECFP é o Cerulean, que tem um coeficiente de extinção e um rendimento quântico mais elevados. É 1,5 vezes mais brilhante que o ECFP e é usado como um parceiro FRET com YFP.
Uma mutação GFP que não altera diretamente um dos três aminoácidos centrais no cromóforo resultou no aumento de proteínas fluorescentes amarelas. Os YFPs têm uma trionina comum na posição 203 que é trocada por uma tirosina (T203Y). Este aminoácido faz parte do barril β e está muito próximo do cromóforo. Em comparação com o GFP, as propriedades de excitação e emissão foram deslocadas para comprimentos de onda mais longos com os máximos de excitação e emissão a 514 nm e 527 nm (EYFP). Uma característica do EYFP é a sua sensibilidade ao pH. A pH 6,5 EYFP tem apenas cerca de 50% de sua fluorescência, o que nem sempre é uma desvantagem. Quando se trata da medição do pH (por exemplo, de vesículas, endossomos, etc.), o APPJ pode ser usado como um indicador. Curiosamente, uma mutação adicional (Q69M) desenvolveu uma melhor estabilidade ácida e melhorou dramaticamente o brilho (75% mais brilhante do que o EGFP). Esta proteína, que ainda tem uma fotoestabilidade fraca em comparação com o EGFP, foi chamada de Citrina. Outro mutante YFP (F46L) mostrou uma velocidade de maturação drasticamente mais rápida e também uma melhor resistência ao pH. Esta proteína foi chamada Vénus e é um aceitador frequente de FRET com Cerulean.