Encontrar uma forma eficaz de inibir as rejeições imunitárias é uma das estratégias mais importantes para apoiar os transplantes clínicos. Recentemente, estudos sobre transplante de órgãos demonstraram que a aplicação do inibidor DPPIV ou do anti-CD26 mAb aumentou o enxerto de células doadoras e diminuiu a DCVH aguda, respectivamente, e indicou a DC26 como um novo alvo para intervenção terapêutica na doença.11 Para esclarecer o papel da DC26 na rejeição alogênica do enxerto, foram utilizados camundongos CD26 knockout em um estudo de transplante cutâneo alogênico. Verificamos que os camundongos CD26-/- apresentaram menor grau necrótico dos enxertos e rejeição tardia dos aloenxertos (Fig. 1).
CD26 é um marcador de ativação de linfócitos T e B e células NK. Como uma molécula co-estimuladora, o CD26 medeia os processos de transdução do sinal das células T através de sua interação com adenosina deaminase, CD45, caveolin-1, ou CARMA1.5 O bloqueio da co-estimulação das células T CD26 mediada por células T induziu anergia nas células T CD4+.24 No presente trabalho, uma porcentagem menor de CD3+, assim como de células CD4+, foram encontradas em MPBLs e MSLs de CD26-/- camundongos tanto pré quanto pós transplante de pele (Fig. 3). Além disso, a infiltração de células CD3+ e CD4+ foi detectada em menor grau nos tecidos do enxerto de camundongos CD26-/- do que em camundongos CD26+/+ após transplante cutâneo (Fig. 7b, c). Este achado indica que a deficiência de CD26 resulta em comprometimento do desenvolvimento, maturação e função das células CD4+, o que corresponde aos nossos achados anteriores.23 Curiosamente, o percentual de células CD8+ em camundongos CD26-/- foi o mesmo que em camundongos CD26+/+ antes do transplante; entretanto, o percentual foi significativamente menor em camundongos CD26-/- do que em camundongos CD26+/+ após o transplante cutâneo (Fig. 3). O número de infiltrações de células CD8+ nos enxertos cutâneos foi nitidamente menor nos CD26-/- do que nos camundongos CD26+/+ após o transplante cutâneo. Estes achados sugerem redução da proliferação, ativação e função das células CD8+ em camundongos CD26-/- em resposta aos antígenos alogênicos. As células CD8+ T são um componente proeminente do repertório alogênico de células T induzido após o transplante alogênico em camundongos; sua atividade citotóxica é direcionada para o complexo de histocompatibilidade maior (MHC) classe I de peptídeos do doador.25 A reduzida porcentagem de células CD8+ em camundongos CD26-/- (Fig. 3) após o transplante alogênico pode contribuir parcialmente para a redução do grau necrótico dos enxertos e retardar a rejeição do aloenxerto. Além disso, as porcentagens de CD3+, CD4+ e CD4+NK1,1- de células CD26-/- em camundongos foram menores do que em camundongos CD26+/+ antes do transplante, mas a diferença foi reduzida após o transplante. Foi relatado que a inibição da CD26 aumentou o homing das células do doador e melhorou o enxerto alogênico.26 A diminuição da diferença percentual de células CD3+ e CD4+ de LMCs entre os dois tipos de camundongos após o transplante pode ser devida ao aumento do homing dessas células para o baço em camundongos CD26-/-
A rejeição do aloenxerto é impulsionada principalmente pelas células T do hospedeiro. Enquanto todos os componentes do sistema imune inato e adaptativo participam da rejeição do enxerto, linfócitos T e, em particular, células CD4+ são de suma importância neste processo.27 Uma vez ativadas, as células T CD4+ dirigem primariamente a progressão da resposta, secretando citocinas que ativam, expandem e/ou recrutam outras células efetoras, como macrófagos, células T CD8+ e células B.27, 28 Através de análise mais aprofundada dos níveis de citocinas em ambos os tipos de camundongos, foi encontrada no soro de camundongos CD26-/- após o transplante alogênico (Fig. 4) uma nítida redução da secreção de IL-2, IFN-γ, IL-6, IL-17, IL-4 e IL-13. Esta diminuição da secreção pode ter sido causada por um menor número de células CD4+ em camundongos CD26-/- antes do transplante; no entanto, deve-se considerar a diferenciação e a função das células CD4+ em resposta ao antígeno alogênico na CD26-/- de camundongos. Baixos níveis séricos de IL-2, IFN-γ e IL-6 indicam diferenciação e função parcialmente defeituosa para células Th1, enquanto baixos níveis de IL-4 e IL-13 indicam diferenciação e função insuficientes de células Th2 em camundongos CD26-/-.
Como uma citocina chave, IFN-γ exibe efeitos diversos e potencialmente contraditórios na rejeição de aloenxertos de órgãos.29 IL-2 é outra citocina associada a Th1 que também tem efeitos complexos na rejeição de aloenxertos.30 Tanto IFN-γ quanto IL-2 são citocinas pleiotrópicas e desempenham um papel importante na proliferação de células T e B durante a reação inflamatória. As citocinas atuam primeiro como moléculas que iniciam o crescimento das células T e sobrevivem durante a resposta imune e depois reforçam a resposta Th1 com feedback positivo.29, 30 Na rejeição aguda, as células Th1 infiltram-se predominantemente em enxertos, nos quais IL-2 e IFN-γ podem induzir a ativação de células NK e macrófagos, que são armas fortes para destruir aloenxertos.29, 30 Além disso, IFN-γ induz a expressão de moléculas MHC classe II e a secreção de IgG2a e IgG3 a partir de células B ativadas. Em um modelo de rejeição aguda, os ratos IFN-γ-/- mostraram rejeição tardia do enxerto cutâneo.31 Vários estudos relataram que a tolerância à rejeição do aloenxerto é mediada, pelo menos em parte, pela IL-4, uma típica citocina das células Th2, promovendo a produção de IL-10 e IgG1.32 Outros estudos têm fornecido resultados conflitantes, indicando que a administração do inibidor Th2 prolonga a sobrevivência do aloenxerto cardíaco.33 A IL-13, que mostra efeitos semelhantes aos da IL-4, é outra citocina associada à resposta Th2; a IL-13 compartilha uma cadeia receptora (IL-4R α-chain) com a IL-4, mas difere nas células-alvo envolvidas, o que resulta em uma série de diferentes eventos biológicos.32 Um número crescente de estudos tem demonstrado que as citocinas de células Th1 e Th2, como a IL-2, IFN-γ e IL-4, são capazes de suportar a expansão clonal das células B e a síntese de anticorpos.28, 34 A deficiência de CD26 resulta em deficiência de diferenciação e função das células Th1 e Th2 em camundongos CD26-/-. Baixos níveis de citocinas Th1 IFN-γ e IL-2 poderiam resultar em diminuição da proliferação de células CD8+ (Fig. 3) e ativação de macrófagos, reduzindo assim a infiltração de células CD8+ e macrófagos em enxertos (Fig. 7) durante a rejeição de aloenxertos. Por outro lado, baixos níveis de IFN-γ, IL-2 e IL-4 em camundongos CD26-/- após transplante alogênico podem prejudicar a ativação e diferenciação das células B, reduzindo a produção de anticorpos (Fig. 2).
Rejeição de imune é um processo complexo que envolve uma resposta imunológica celular e humoral e se caracteriza pela produção de anticorpos por linfócitos B. IgG, o principal componente dos Igs séricos e um anticorpo patogênico comum em pacientes com rejeição de transplante, tem um papel indispensável na lesão dos enxertos durante a rejeição de transplante.35 Em nosso trabalho atual, a baixa produção de IgG e seus subconjuntos, IgG1 e IgG2a, foi detectada no soro de ratos CD26-/- (Fig. 2). Este resultado corresponde aos nossos achados anteriores demonstrando que a produção de anticorpos foi claramente menor em camundongos com CD26-/- do que em camundongos com CD26+/+ após imunização com ovalbumina ou após estimulação mitogênica pokeweed.23, 36 Este achado indica que a diferenciação das células B foi prejudicada pela deficiência de CD26. Na ativação de células B dependentes de células T, é necessária uma interação entre células B e células Th e certas citocinas de Th1 e Th2 para suportar a expansão clonal das células B e a síntese de anticorpos. Em ratos CD26-/-, uma baixa percentagem de células Th (CD4+) (Fig. 3) e uma baixa produção de IL-2 e IL-4 (Fig. 4) podem levar a uma activação e diferenciação deficiente das células B, reduzindo assim a produção de IgG. A IgG é um componente importante que medeia o reconhecimento entre antígenos exógenos e células CD8+ receptoras durante a rejeição do enxerto.37 Baixa produção de IgG em camundongos CD26-/- (Fig. 2) pode, portanto, resultar na redução do ataque de enxerto pelas células efetoras.
Interessantemente, o nível de secreção de IL-10 foi maior em camundongos CD26-/- (Fig. 4G). Apoiando nossos resultados, o bloqueio CD26/DPPIV demonstrou melhorar o transplante de aloenxertos pulmonares e aumentar a expressão da IL-10.38 A IL-10 é conhecida por ser uma citocina antiinflamatória; a IL-10 foi relatada para diminuir a expressão de citocinas Th1 e Th17 no processo inflamatório, particularmente durante a sinalização das células Treg.39 Vários tipos de células produzem IL-10, incluindo Th2 e macrófagos, assim como células T reguladoras.40 Em camundongos CD26-/-, os altos níveis de secreção de IL-10 (Fig. 4g) podem ter sido resultado de uma alta porcentagem de Tregs (Fig. 6). Notavelmente, em resposta ao transplante alogênico, níveis elevados de IL-6 foram detectados no soro de camundongos CD26+/-+ desde o primeiro dia e atingiram seu pico no 7º dia após o transplante; entretanto, apenas uma pequena quantidade de IL-6 foi detectada no soro de camundongos CD26-/- até o 7º dia após o transplante (Fig. 4d). Estudos recentes demonstraram que a IL-6 desempenha um papel muito importante na regulação do equilíbrio entre as células Th17 produtoras de IL-17 e Tregs.41 Assim, o baixo nível de IL-17 e a alta porcentagem de Tregs observada em camundongos CD26-/- no presente estudo (Fig. 5 e 6) poderia ter sido em parte devido à redução da função da IL-6 e ao excesso de atividade da IL-10.
Além disso, foi relatado que células Th17 humanas são caracterizadas pela alta expressão de CD26,18 que é um marcador de seleção negativo para Tregs humanos,19 sugerindo que o CD26 está envolvido na diferenciação e função das células Th17, mas não está relacionado a Tregs. Portanto, não é surpreendente que tenha sido observado um comprometimento do equilíbrio da diferenciação de Th17 e Tregs em camundongos CD26-/-. Embora a rejeição de aloenxertos esteja tradicionalmente associada à diferenciação do Th1, muitos estudos recentes mostraram que células Th17 e IL-17 estavam intimamente associadas à rejeição de aloenxertos.42 As células Th17 são uma adição mais recente ao paradigma das células T, enquanto a IL-17, uma das principais citocinas Th17, é um fator pró-inflamatório.43 A acumulação de evidências sugere que as células Th17 desempenham um papel importante no desenvolvimento de lesões crônicas de aloenxertos no transplante de vários órgãos. A marca registrada da rejeição de aloenxertos com células Th17 é a capacidade da IL-17 de recrutar neutrófilos, que são uma das primeiras células efetoras inflamatórias capazes de se infiltrar no aloenxerto após o transplante, causando assim danos aos aloenxertos.42 Por outro lado, Tregs desempenha um papel crucial na tolerância imunológica e no controle negativo de várias respostas imunológicas através da supressão ou da desregulamentação de outras células efetoras T durante a rejeição imunológica.44 Foi relatado que a inibição da CD26/DPPIV promove a secreção de TGF-β1 que é essencial para a diferenciação de Tregs.45 Para o desenvolvimento e função das células CD4+CD25+ Treg, o fator de transcrição da cabeça do garfo (Foxp3) é necessário.46 A IL-10 é relatada como um fator importante na manutenção da expressão da FoxP3.47 O alto nível de IL-10 observado em ratos CD26-/- (Fig. 4g) pode ter beneficiado a expressão da FoxP3. A redução da atividade de Th17 e o aumento da porcentagem de Tregs em LMS e MPBL de camundongos CD26-/- após o transplante alogênico são assumidos como a razão mais importante para a redução da necrose do enxerto e retardo na rejeição do aloenxerto em camundongos CD26-/-.
Certas quimiocinas contribuem para a infiltração de macrófagos nos tecidos do enxerto, tais como proteínas quimiotáticas monócitas (MCP-1, -2, -3), fator estimulante da colônia de macrófagos (M-CSF ou CSF-1), e ligando quimiocinas 5 (CCL5 ou RANTES (células T reguladas e normais expressas e segregadas)).48 Como substratos do DPPIV/CD26, MCPs e RANTES podem ser truncados pelo DPPIV, seguido pela alteração de sua quimiotáxica.3 Verificou-se que as PMCs com um Lys amino-terminal podem ser clivadas pela CD26/DPPIV e podem resultar na inativação de sua quimiotaxia; entretanto, a PMC com um pGlu NH2-terminal permaneceu inalterada.49 O efeito da CD26 nas diferentes isoformas de PMC envolvidas na quimiotaxia de macrófagos durante o transplante cutâneo deve ser investigado mais detalhadamente. A truncagem do CCL5/RANTES pelo DPPIV foi relatada para diminuir sua ligação ao receptor de quimiocina 1 (CCR1) e CCR3, mas aumentou sua ligação à CCR5, contribuindo para o recrutamento de macrófagos em enxertos renais.48 A deficiência CD26 de CD26-/- ratos provavelmente reduziu a atividade de ligação de CCL5/RANTES a CCR5 e resultou na redução da infiltração de macrófagos em enxertos.
CD26 é uma proteína multifuncional, exibindo atividade enzimática ou interagindo com moléculas diferentes. Estudos recentes relataram que a CD26/DPPIV está envolvida na cicatrização de feridas cutâneas. Taxas mais altas de fechamento da ferida, revascularização e proliferação celular foram observadas em ratos CD26-/-, e o inibidor DPPIV mostrou um benefício potencial na cicatrização da ferida.50 No caso do transplante de pele, o CD26 está envolvido não apenas na rejeição imunológica, mas também no processo de cicatrização da ferida; assim, o CD26 tem um papel semelhante ao de Janus na gravação e rejeição. No presente trabalho, o nível necrótico nos enxertos e os níveis de IgG e citocinas relacionadas no soro de CD26-/- ratos foram marcadamente inferiores aos dos ratos CD26+/+. Entretanto, a partir do 13º dia pós-transplante, os enxertos foram removidos e as feridas sararam rapidamente em camundongos CD26-/-. A redução da rejeição de aloenxertos em camundongos CD26-/-, como observado em nosso trabalho atual, pode ser parcialmente neutralizada pelo aprimoramento da cicatrização da ferida, onde o CD26 está envolvido em ambos os processos.
Em conclusão, nossos resultados indicam que o CD26 está envolvido na rejeição alogênica dos enxertos. A deficiência de CD26 resultou numa diferenciação parcialmente prejudicada das subpopulações Th1, Th2 e Th17, mas aumentou a percentagem de Tregs. Por sua vez, as funções reduzidas de Th1, Th2 e Th17 afetaram a diferenciação das células B e diminuíram as atividades das células CD8+ e macrófagos, levando a uma menor produção de IgGs e retardando a rejeição de aloenxertos em camundongos CD26-/-
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