Vias extrínsecas versus vias intrínsecas da apoptose em quimioterapia anticancerígena

Sinalização através da via intrínseca da apoptose

Na via mitocondrial da apoptose, A ativação caspase está intimamente ligada à permeabilização da membrana mitocondrial externa por membros proapoptóticos da família Bcl (Green e Kroemer, 2004). Numerosos estímulos citotóxicos e moléculas de transmissão de sinal proapoptótico convergem nas mitocôndrias para induzir a permeabilização da membrana mitocondrial externa (Decaudin et al., 1998; Green e Kroemer, 2004). Esta permeabilização é regulada por proteínas da família Bcl-2, lipídios mitocondriais, proteínas que regulam o fluxo do metabolito bioenergético e componentes do poro de transição da permeabilidade (Green e Kroemer, 2004). Na ruptura da membrana mitocondrial externa, um conjunto de proteínas normalmente encontrado no espaço entre as membranas mitocondriais interna e externa é liberado, incluindo citocromo c, Smac/DIABLO, Omi/HtrA2, AIF e endonuclease G (Saelens et al., 2004). Uma vez no citosol, essas proteínas apoptogênicas desencadeiam a execução da morte celular, promovendo a ativação da caspase ou agindo como efetivadores da morte independente da caspase (Saelens et al.., 2004).

Mitocondrial mediators of caspase-dependent apoptosis

Citocromo c

A liberação do citocromo c das mitocôndrias desencadeia diretamente a ativação da caspase-3 através da formação do complexo apoptossômico c/Apaf-1/caspase-9 (Cain et al., 2000). Uma vez no citosol, o citocromo c liga-se à região terminal C do Apaf-1, uma proteína citosólica com um domínio N-terminal de caspase-recruitment (CARD), um domínio de ligação de nucleotídeos com homologia a Caenorhabditis elegans CED-4 e um domínio C-terminal contendo repetições 12-13 WD-40 (Zou et al., 1997). A ligação do citocromo c ao Apaf-1 facilita a associação do dATP com o Apaf-1 e expõe o seu N-terminal CARD, que pode agora oligomerizar e tornar-se uma plataforma na qual o iniciador caspase-9 é recrutado e activado através de uma interacção CARD-CARD (Adrain et al., 1999). Consecutivamente, o executor caspase-3 é recrutado para o apoptosome, onde é activado pela caspase-9 residente (Bratton et al., 2001). A caspase-3 então cliva os substratos chave na célula para produzir muitos dos eventos celulares e bioquímicos da apoptose.

Em certos casos, a atividade da caspase-c instigada pelo citocromo citosólico contribui para a queda da metaloproteinase matriz (MMP), como foi demonstrado pelo uso de inibidores de caspase sintética e células Apaf1 -/- (Waterhouse et al., 2001). Além disso, a atividade da caspase prejudica ainda mais a função da mitocôndria permeabilizada, afetando a atividade dos complexos I e II, levando inevitavelmente à perda da MMP e à geração de espécies reativas de oxigênio (Ricci et al., 2004). Assim, eventos secundários resultantes de alterações citosólicas, causadas pela liberação de citocromo c e outras proteínas IMS mitocondriais, podem alimentar as mitocôndrias permeabilizadas e afetar sua função. É importante ressaltar que este laço de amplificação mitocondrial da atividade da caspase pode determinar criticamente a resposta das células cancerosas aos tratamentos citotóxicos.

Além disso, há evidências recentes da existência de um mecanismo independente do citocromo c e apoptose, mas dependente do Apaf-1 para ativação da caspase. A introdução de uma variante do citocromo c que não possui propriedades apoptogênicas, mas com transferência de elétrons e atividade antioxidante (K72A), permitiu avaliar a contribuição do citocromo c para a apoptose sem afetar sua função na fosforilação oxidativa (Hao et al., 2005). Curiosamente, os timócitos dos camundongos KA/KA foram marcadamente mais sensíveis a estímulos de morte, incluindo etoposídeo e γ-irradiação do que os timócitos Apaf-1(-/-) (Hao et al., 2005). No tratamento com o γ-irradiação, as procaspases foram eficientemente ativadas nos timócitos apoptóticos KA/KA, mas a oligomerização Apaf-1 não foi observada (Hao et al., 2005) apontando para um requerimento diferencial para citocromo c e Apaf-1 na apoptose.

Smac/DIABLO

Outras proteínas liberadas de mitocôndrias, como Smac/DIABLO e Omi/HtrA2, facilitam a ativação da caspase através da neutralização dos inibidores endógenos das caspases, o inibidor das proteínas da apoptose (IAPs). Smac e seu homólogo murino DIABLO são proteínas mitocondriais codificadas nuclearmente, que contêm um sinal de localização mitocondrial, que é removido proteoliticamente na importação mitocondrial para produzir a proteína 23 kDa madura (Du et al., 2000; Verhagen et al., 2000). Esta etapa de maturação expõe o motivo de ligação IAP (IBM) no N-terminus de Smac/DIABLO (Du et al., 2000) (Tabela 1). O segundo ativador mitocondrial de caspase/DIABLO foi mostrado para ligar-se ao XIAP, cIAP1, cIAP2, survivin e Apollon de forma dependente do BIR (Vaux e Silke, 2003) (Figura 2), e atua como homodímero com o IBM presente em uma configuração bivalente (Chai et al., 2000). Um dímero Smac/DIABLO liga uma molécula XIAP por ambos os motivos IAP-binding, um interagindo com BIR2 e outro com BIR3 (Huang et al., 2003). Intrigantemente, a mesma ranhura BIR3 liga a IBM exposta no N-terminus (Ala-Thr-Pro-Phe) da pequena subunidade da caspase-9 após seu processamento autocatalítico após Asp315, permitindo ao Smac/DIABLO deslocar a caspase-9 da XIAP (Srinivasula et al., 2001) (Tabela 1).

A função mitocondrial fisiológica de Smac/DIABLO é desconhecida, e DIABLO -/- ratos parecem normais (Okada et al., 2002). Embora a clivagem in vitro do procaspase-3 após adição de citocromo c tenha sido inibida em lisados de células Smac -/-, Smac -/- ratos e células responderam normalmente a estímulos apoptóticos como irradiação UV, estaurosporina, etoposídeo e TNF/ciclohexamida (Okada et al., 2002). Estas observações sugerem a existência de fatores redundantes compensando a perda de Smac/DIABLO, possivelmente HtrA2/OMI.

Omi/HtrA2 é uma proteína codificada nuclear, 49 kDa com um sinal de localização mitocondrial N-terminal que medeia sua translocação para o espaço intermembrana mitocondrial (Suzuki et al., 2001; Martins et al., 2002; van Loo et al., 2002). Omi/HtrA2 é processado no espaço intermembrana na forma madura de 37 kDa, liberando um IBM em seu termo N (Suzuki et al., 2001; Martins et al., 2002; van Loo et al., 2002) (Tabela 1). Embora o Omi/HtrA2 recombinante possa catalisar sua própria maturação in vitro, a protease responsável por sua maturação em células permanece desconhecida (Martins et al., 2002). Omi/HtrA2 desempenha um papel essencial na regulação da homeostase mitocondrial que requer a sua actividade proteolítica, embora os alvos moleculares e parceiros de interacção de Omi/HtrA2 na mitocôndria ainda não tenham sido definidos (Saelens et al., 2004). Uma vez que o Omi/HtrA2 é liberado da mitocôndria para o citosol, ele promove a morte celular de forma caspase-dependente, antagonizando os PAIs, e de forma caspase-independente como protease (Saelens et al., 2004). Semelhante ao Smac/DIABLO, Omi/HtrA2 bloqueia IAPs através de seu motivo N-terminal de ligação IAP, apresentado em uma configuração trimérica (Li et al.., 2002)

Embora a liberação do citocromo c no citosol acione diretamente a ativação da caspase-3 através da formação do complexo apoptossômico c/Apaf-1/caspase-9, Smac/DIABLO e Omi/HtrA2 promovem indiretamente a ativação da caspase-3 através do antagonismo dos efeitos inibidores das IAPs (Saelens et al., 2004). Assim, existe um equilíbrio dinâmico entre as moléculas efetoras pró- e antiapoptóticas, o que permite à célula lidar com danos mitocondriais limitados, caso em que as PIA podem bloquear adequadamente a ativação da caspase iniciada por uma pequena quantidade de citocromo c liberado. No entanto, em circunstâncias onde o dano mitocondrial prossegue ou afeta simultaneamente múltiplas mitocôndrias, o obstáculo antiapoptótico imposto pelas IAPs pode ser superado pela maior concentração citosólica de seus antagonistas Smac/DIABLO e HtrA2/OMI, que neutralizam as IAPs pela ligação direta.

Existem provas crescentes de que as células cancerosas têm um impulso intrínseco à apoptose que é mantido em controle pelas IAPs. Para este fim, níveis basais elevados de atividades caspase-3 e caspase-8 e fragmentos ativos de caspase-3 na ausência de apoptose foram detectados em várias linhas de células tumorais e tecidos cancerígenos, mas não em células normais (Yang et al., 2003a). Células tumorais, mas não células normais também expressaram altos níveis de PIA, sugerindo que a expressão não-preparada de PIA contrariou a alta atividade caspase basal seletivamente nas células tumorais (Yang et al., 2003a). Portanto, estratégias visando os PIA são consideradas como uma abordagem promissora para melhorar a eficácia das terapias citotóxicas seletivamente nas células cancerígenas. Para este fim, a expressão transfusional de Smac/DIABLO baixou o limiar para a morte induzida por TRAIL em diferentes tumores (Ng e Bonavida, 2002; Okano et al., 2003) e também células cancerosas sensibilizadas para quimioterapia (McNeish et al., 2003; Zhao et al., 2006). Entretanto, a translocação de Smac/DIABLO endógeno para o citosol durante a apoptose anticancerígena não parece desempenhar um papel importante sob certas condições, por exemplo, em células cancerígenas do pulmão humano após tratamento com etoposídeo (Bartling et al., 2004). A desregulação do Smac/DIABLO por pequena interferência do RNA (siRNA) não influenciou a morte por etoposídio nessas células, embora um peptídeo Smac-N7 de ligação IAP tenha aumentado a apoptose induzida por etoposídeos (Bartling et al., 2004). Esses dados sugerem que a deficiência de Smac/DIABLO pode ser compensada pela ação de determinantes redundantes em certas células cancerígenas.

Mediadores mitocondriais da apoptose caspase-independente

Upão sua liberação do espaço intermembrana mitocondrial, HtrA2/OMI contribui para a morte celular também de forma caspase-independente como protease, além de promover a apoptose de forma caspase-dependente, antagonizando os PAIs (Suzuki et al, 2001; Martins et al., 2002; van Loo et al., 2002). Dados in vitro demonstraram a degradação do XIAP, cIAP1, cIAP2 e Apollon pela atividade protease do HtrA2/OMI (Suzuki et al., 2004). Além disso, Trencia et al. (2004) demonstraram a interação do PED/PEA-15 antiapoptótico com, e sua degradação pelo HtrA2/OMI citosólico. A diminuição dos níveis de HtrA2/OMI nas células por interferência antisense ou RNA diminui a sensibilidade das diferentes linhas celulares cancerígenas à morte celular induzida pela estaurosporina, Fas, UV ou cisplatina (Martins et al, 2002).

Outras vezes, AIF e endonuclease G são liberadas das mitocôndrias na permeabilização da membrana mitocondrial externa e translocam-se para o núcleo para contribuir para a condensação da cromatina nuclear e fragmentação do DNA em larga escala (Cande et al., 2004; Saelens et al., 2004). Se essas duas proteínas são liberadas antes, juntas ou após o citocromo c tem sido discutido de forma controversa (Arnoult et al., 2002). Além disso, ainda não é claro como é que a AIF contribui para a fragmentação do DNA nuclear, uma vez que lhe falta a actividade intrínseca do DNase. Em células de mamíferos, a ciclofilina A, uma cis-trans isomerase peptídilo-prolil, coopera com AIF para induzir a quebra do DNA (Cande et al., 2004).

Disrupção da via intrínseca no cancro

Mutações nos genes envolvidos na regulação da via mitocondrial são muito comuns nas células cancerosas. Como a maioria das terapias anticancerígenas induzem apoptose nas células cancerosas desencadeando a via intrínseca, tais mutações estão geralmente associadas à resistência ao tratamento. Por exemplo, a sobreexpressão do Bcl-2, como resultado da translocação cromossômica do oncogene do bcl-2 para o locus do gene da cadeia pesada da imunoglobulina, está associada a aproximadamente 85% do linfoma folicular humano (Tsujimoto et al., 1984). Experimentos com ratos transgênicos demonstraram que a superexpressão do Bcl-2 pode promover transformação neoplásica de linfócitos B e T e células mielóide (McDonnell e Korsmeyer, 1991; Traver et al., 1998).

Dado o fato de que a superexpressão dos membros da família Bcl-2 antiapoptóticos promove oncogênese, segue-se que os membros proapoptóticos multi domínio BH desta família atuam como supressores tumorais. Entretanto, uma vez que Bax e Bak têm papéis amplamente sobrepostos na apoptose, tem sido difícil determinar se esta hipótese é verdadeira e, de fato, os ratos bax-/- não são marcadamente predispostos à neoplasia (Knudson et al., 2001). Entretanto, mutações somáticas que inativam o gene do bax-/- foram encontradas em certos tumores sólidos e neoplasias hematológicas malignas. Para este fim, foram descritas a substituição de nucleotídeos simples ou mutações frameshift, que inativam o gene Bax em câncer de cólon ou neoplasias malignas hematopoéticas (Rampino et al., 1997; Kitada et al., 2002).

Mais ainda, há evidências crescentes de que proteínas somente BH3 podem contribuir para a supressão da transformação maligna, indicando que elas podem funcionar como supressores tumorais de boa fé. Por exemplo, foi demonstrado que a perda de um único alelo de Bim acelera a linfomogênese de células B induzida pela expressão de um transgene c-myc (Egle et al., 2004), em linha com o papel-chave de Bim como regulador da homeostase linfóide (Strasser, 2005). Curiosamente, deleções homozigotos na região cromossômica que abriga o gene bim foram recentemente identificadas em pacientes com linfoma de células mantélicas (Tagawa et al., 2005). Camundongos sem bid espontaneamente desenvolvem uma doença mieloproliferativa que pode progredir para uma leucemia mielomonocítica crônica (CMML) (Zinkel et al., 2003). Além disso, RNAi-mediated suppression of Puma was reported to accelerate Myc-induced lymphomagenesis (Hemann et al., 2004).

In addition to genetic alterations, aberrant expression of Bcl-2 family proteins is mostly regulated at the transcriptional or post-transcriptional level. Por exemplo, a expressão de várias proteínas antiapoptóticas da família Bcl-2, por exemplo, Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1 ou Bfl-1, é regulada transcrição por NF-κB (Cory e Adams, 2002).

Proteínas da família Bcl-2, diminuída ou ausente atividade de Apaf-1 foi encontrada no câncer ovariano, melanoma e leucemia. Além disso, mutações no gene supressor do tumor p53, o defeito genético mais comum em cânceres humanos, interferem na via intrínseca. Por exemplo, a ativação do p53 upregula uma série de genes que possuem elementos p53-responsivos presentes em seus promotores, como as proteínas proapoptóticas BH3 apenas Puma, Noxa e Bid (Oda et al., 2000; Yu et al., 2001; Sax et al., 2002). Como resultado, células nas quais a p53 está estabilizada são sensibilizadas para a ativação da via de morte das células mitocondriais. Além disso, a p53 pode afetar diretamente a integridade mitocondrial sem a necessidade de ativação do gene. De fato, tem sido relatado que o p53 pode se ligar ao Bcl-2 e Bcl-XL na mitocôndria, promovendo assim a desestabilização mitocondrial (Mihara et al., 2003).

Sinalização pela via intrínseca na terapia do câncer

Mais convencionais agentes quimioterápicos, por exemplo, etoposídeo, doxorubicina, cisplatina ou paclitaxel, provocam a permeabilização mitocondrial de forma indireta, provocando perturbações do metabolismo intermediário ou aumentando a concentração de segundos mensageiros proapoptóticos, por exemplo, induzindo a expressão p53, induzindo a via ceramida/GD3, induzindo o sistema ligante CD95/CD95L, afetando as proteínas do tipo Bcl-2 e/ou comprometendo o redox ou o balanço energético.

Existem evidências crescentes da existência de uma conversa cruzada nucleo-mitocondrial após dano no DNA. Por exemplo, sinais apoptóticos decorrentes de dano ao DNA podem ser transmitidos através do supressor tumoral p53 para mitocôndrias, que por sua vez liberam fatores apoptógicos no citoplasma que ativam programas de destruição a jusante (Moll et al., 2005). p53 pode indiretamente engajar a via mitocondrial ativando transcritivamente a expressão de proteínas proapoptóticas Bcl-2, por exemplo, Bid, Puma ou Noxa (Oda et al., 2000; Yu et al., 2001; Sax et al., 2002). Além disso, p53 pode desencadear diretamente a permeabilização da membrana mitocondrial externa de forma independente de transcrição através da ativação direta das proteínas Bcl-2 proapoptóticas Bax ou Bak ou através da ligação e inativação das proteínas Bcl-2 antiapoptóticas como Bcl-2 ou Bcl-XL (Mihara et al., 2003; Chipuk et al., 2004; Moll et al., 2005). Importante, a mitocondrially targeted p53 demonstrou recentemente possuir atividades de supressão tumoral também in vivo (Talos et al., 2005).

Além disso, a caspase-2 possui a habilidade de engajar a via apoptótica mitocondrial em resposta à lesão do DNA, permeabilizando a membrana mitocondrial externa e/ou quebrando a associação do citocromo c com a membrana mitocondrial interna. Assim, células estavelmente transfectadas com procaspase-2 antisense, ou expressando transientemente siRNA, foram refratárias à liberação do citocromo c e vários eventos a jusante, como ativação da caspase e fragmentação do DNA, induzidos por danos no DNA (Lassus et al., 2002; Robertson et al., 2002). A caspase-2 pode atuar indiretamente sobre as mitocôndrias, por exemplo, clivando a proteína proapoptótica Bid, seguida de sua translocação para as mitocôndrias para induzir a liberação do citocromo c (Guo et al., 2002). Adicionalmente, a caspase-2 pode permeabilizar diretamente a membrana mitocondrial externa e estimular a liberação de citocromo c e Smac/DIABLO, possivelmente como resultado da interação direta da caspase-2 processada com proteínas putativas e/ou fosfolípidos localizados na membrana mitocondrial externa, ou em locais de contato entre as membranas externa e interna (Robertson et al., 2004). A permeabilização da membrana mitocondrial externa requer o processamento da caspase-2 zymogen mas não a atividade proteolítica associada e ocorre independentemente de várias proteínas da família Bcl-2, incluindo Bax, Bak e Bcl-2 (Robertson et al., 2004). Além disso, a caspase-2 também demonstrou ter a surpreendente capacidade de interromper a associação entre o citocromo c e os fosfolípidos aniônicos, notadamente a cardiolipina, tornando assim o citocromo c adicional disponível para liberação no citosol (Enoksson et al., 2004). Após danos no DNA, foi relatado recentemente que a caspase-2 foi ativada no chamado PIDDosome, um complexo da proteína PIDD P53-induzível, com domínio de morte, caspase-2 e a proteína adaptável RAIDD (Tinel e Tschopp, 2004), apontando para a existência de uma via apoptótica nucleo-mitocondrial.

Adicionalmente, o histone H1.2 tem sido relatado para desempenhar um papel importante na transmissão de sinais apoptóticos do núcleo para a mitocôndria após as quebras de dupla cadeia de DNA (Konishi et al., 2003). A histona nuclear H1.2 é liberada no citoplasma através de um mecanismo dependente de p53 após a quebra da dupla corda de DNA e a liberação do citocromo c de mitocôndrias isoladas de forma dependente de Bak (Konishi et al., 2003). A redução da expressão H1.2 aumentou a resistência celular à apoptose induzida pela irradiação de raios X ou etoposídeo (Konishi et al., 2003).

Além disso, o receptor nuclear órfão Nur77 (também conhecido como TR3) foi recentemente acoplado ao mecanismo apoptótico Bcl-2 na mitocôndria (Lin et al., 2004). A ligação de Nur77 à região do laço terminal Bcl-2 N, localizada entre seus domínios BH4 e BH3, induz uma mudança conformacional Bcl-2 que expõe seu domínio BH3, resultando na conversão do Bcl-2 de um protetor para um assassino (Lin et al., 2004). Curiosamente, níveis elevados de um membro da família Nur77 têm sido associados a respostas favoráveis a agentes quimioterápicos em pacientes (Shipp et al., 2002).

Outras vezes, com o estresse celular, incluindo drogas quimioterápicas, membros específicos da família proapoptótica Bcl-2 são ativados, despressurizados ou induzidos, e assim atuam como sensores. A atividade das proteínas somente do BH3 é mantida sob controle por vários mecanismos, mantendo estas proteínas longe das contrapartidas multidomínio Bcl-2 em circunstâncias normais, mas permitindo sua rápida ativação sob condições de estresse (Bouillet e Strasser, 2002). Como mencionado acima, as proteínas da família Bcl-2 como Bid, Puma ou Noxa estão sob o controle transcripcional do supressor tumoral p53 e, portanto, upreguladas em resposta aos agentes nocivos ao DNA (Oda et al., 2000; Yu et al., 2001; Sax et al., 2002). A proteína Bim, somente BH3, que está associada ao citoesqueleto por ligação a microtubos, é liberada e ativa a via intrínseca após tratamento com taxol, que atua na montagem dos microtubos (Sunters et al., 2003). Recentemente, foi demonstrado que o paclitaxel induz o acúmulo de Bim e a apoptose dependente de Bim em tumores epiteliais in vitro e também in vivo (Tan et al., 2005). Proteínas BH3 ativas ligam e neutralizam os antiapoptóticos e, em alguns casos, ativam membros da família Bcl-2 proapoptóticos multidomínios, levando à perda da permeabilidade da membrana mitocondrial (Bouillet e Strasser, 2002). Como as proteínas Bcl-2 induzem distúrbios da membrana mitocondrial externa ainda é uma questão de debate e pode envolver a capacidade de formação de poros e auto-oligomerização de algumas proteínas da família Bcl-2, modulação do poro de transição da permeabilidade mitocondrial pelas proteínas da família Bcl-2 e/ou alterações lipídicas e interações lipídicas dentro das membranas mitocondriais. Além disso, agentes quimioterápicos como o paclitaxel causam hiperfosforilação e inativação da Bcl-2 e, simultaneamente, favorecem a abertura do poro de transição de permeabilidade (TP) (Ruvolo et al, 2001).

As drogas quimioterápicas também podem induzir ou facilitar a permeabilização da membrana mitocondrial externa através de alterações nos potenciais redox celulares devido a uma maior geração de espécies reativas de oxigênio (ou a uma diminuição de sua desintoxicação), esgotamento do glutationa reduzido ou esgotamento do NADPH, já que o mega-canal mitocondrial possui vários sítios sensíveis ao redox (Debatin et al., 2002). Além disso, mudanças no metabolismo energético, por exemplo, o depleção no ADP e ATP, podem facilitar a abertura dos poros de transição de permeabilidade (PTPC), uma vez que ADP e ATP são os ligantes fisiológicos do translocador de adenina nucleotídeos, que funcionam como inibidores endógenos do PTPC (Costantini et al., 2000). Além disso, a desacoplamento ou inibição da cadeia respiratória ou alcalinização matricial pode favorecer a permeabilização da membrana mitocondrial. Além disso, mensageiros lipídicos como a ceramida, que é gerada em células expostas a diversos estímulos indutores de apoptose, incluindo drogas citotóxicas, podem contribuir para a permeabilização da membrana mitocondrial (Susin et al., 1997). Em altas concentrações. algumas drogas quimioterápicas, por exemplo, etoposídeo ou paclitaxel, também podem induzir a permeabilização da membrana mitocondrial externa em mitocôndrias isoladas (Robertson et al., 2000; Kidd et al., 2002).

Além disso, um número crescente de drogas anticancerígenas experimentais, incluindo arsenita, lonidamida, o retinóide sintético CD437 ou o produto natural ácido betulínico, têm demonstrado atuar diretamente nas mitocôndrias (Debatin et al., 2002). Por exemplo, foi relatado que o ácido betulínico desencadeia apoptose por induzir diretamente a perda do potencial da membrana mitocondrial em mitocôndrias isoladas de uma forma que não é afetada pelo inibidor caspase Z-VAD-fmk e ainda é inibida pelo BA, um inibidor do PTPC, ou pelo Bcl-2 e Bcl-XL (Fulda et al, 1998b).

Estratégias visando a via intrínseca

Proteínas da família Bcl-2

Proteínas Bcl-2 antiapoptóticas, que bloqueiam potentemente a via intrínseca da apoptose, são encontradas em níveis elevados em cancros humanos de origem hematológica e não hematológica (Cotter, 2004), elas representam alvos promissores para intervenções terapêuticas. Consequentemente, várias estratégias têm sido desenvolvidas para atingir as proteínas Bcl-2, por exemplo, técnicas anti-senso, peptídeos de BH3-domínio ou pequenas moléculas sintéticas que interferem com a função das proteínas do tipo Bcl-2. Para diminuir a expressão da Bcl-2, oligonucleotídeo Bcl-2 antisense (genasense) foi desenvolvido pela Genta Incorporated (Berkeley Heights, NJ, EUA). Genasense é um oligonucleotídeo sintético, de 18 bases, de cadeia única de fósforotiodo que visa seletivamente os primeiros seis códons (ou seja, 18 bases) do quadro de leitura aberta do mRNA que codifica a proteína Bcl-2 (Cotter, 2004). O tratamento com genasense aumentou acentuadamente a atividade antitumoral de muitos medicamentos quimioterápicos, por exemplo, taxanos, antraciclinas, alquiladores ou agentes que contêm platina (Cotter, 2004). Em um modelo pré-clínico de melanoma, o pré-tratamento com genasense aumentou a quimiossensibilidade do melanoma humano (Jansen et al., 1998). Também em um ensaio clínico, genasense foi relatado para atuar como quimiossensibilizador de dacarbazina em pacientes com melanoma maligno (Jansen et al., 2000). Para otimizar a terapia baseada no antisenso, oligonucleotídeos bisespecíficos antisensos dirigidos contra uma sequência, que é altamente homóloga em Bcl-2 e Bcl-xL, mas ausente em Bcl-xS mRNA, foram posteriormente desenhados (Zangemeister-Wittke et al., 2000). A desregulamentação simultânea da apoptose induzida pelo Bcl-2 e Bcl-xL e o aumento da quimiossensibilidade em várias células cancerosas (Gautschi et al., 2001; Tortora et al., 2003; Milella et al., 2004; Yamanaka et al., 2005).

Outras vezes, os peptídeos de domínio BH3 ou inibidores de pequenas moléculas sintéticas foram desenvolvidos para atacar proteínas anti-apoptóticas do tipo Bcl-2. O domínio BH3 compreende um anfíbio de nove amino-ácidos α-helix que se liga a uma bolsa hidrofóbica de proteínas do tipo Bcl-2 (Cory e Adams, 2002). Da mesma forma, os peptídeos do domínio BH3 visam perturbar este complexo, sensibilizando assim as células cancerosas para o apoptosi (Letai et al., 2002). Adicionalmente, a substituição do domínio Bid BH3 por aminoácidos não naturais na superfície oposta à região de interação por grampeamento de hidrocarbonetos resultou na estabilização dos peptídeos de BH3 denominados SAHBs (estável α-helix de domínios Bcl-2), com propriedades farmacológicas melhoradas (Walensky et al., 2004). Esses peptídeos de BH3 estabilizados desencadearam apoptose em várias linhas celulares leucêmicas e também inibiram o crescimento de xenogertos de leucemia em ratos sem efeitos colaterais adversos (Walensky et al., 2004).

Também foram identificados vários compostos de pequenas moléculas interferindo na função Bcl-2/Bcl-xL. A triagem de uma biblioteca química para compostos capazes de se ligar à bolsa de BH3 das proteínas Bcl-2 resultou na identificação de HA14-1, um composto que compete com Bak para a ligação ao Bcl-2 (Wang et al., 2000). Ao triar uma biblioteca de 16 320 compostos pré-selecionados para a capacidade de deslocar um peptídeo Bak BH3 fluorescente de Bcl-xL em um ensaio de polarização fluorescente, Degterev et al. (2003) identificaram duas classes de agentes chamados inibidores de BH3 (IBH3), que também perturbam o complexo Bcl-xL com Bax e Bad em células intactas.

Usando ressonância magnética nuclear (RNM), síntese paralela e desenho baseado em estrutura, foi recentemente descoberto um inibidor de pequenas moléculas das proteínas antiapoptóticas Bcl-2, Bcl-X(L) e Bcl-w, ABT-737. O ABT-737 foi eficaz como agente único contra certos linfomas e tumores sólidos e mostrou citotoxicidade sinérgica com quimioterápicos e radiação (Oltersdorf et al., 2005).

Smac/DIABLO agonistas

Para o desenho de pequenas moléculas potencialmente terapêuticas para o XIAP, o sulco de ligação do domínio BIR3 do XIAP, ao qual o Smac/DIABLO se liga após sua liberação da mitocôndria, tem atraído mais atenção. A análise estrutural forneceu uma lógica clara para a síntese de pequenos compostos que podem imitar a atividade de deslocamento da caspase-9 do Smac/DIABLO da XIAP BIR3 (Chai et al., 2000; Wu et al., 2000). Para melhorar o parto intracelular, os peptídeos de Smac foram ligados a um portador, por exemplo, o motivo da transdução da proteína Tat (Fulda et al., 2002), a sequência de penetração da antennapaedia Drosophila (Arnt et al., 2002) ou um estiramento de poliarginina (Yang et al., 2003b). Um heptapéptido representando o N-termino do Smac/DIABLO maduro, essencial para a ligação ao XIAP, foi relatado para promover a ativação da caspase e para sensibilizar várias linhas de células tumorais e também células tumorais derivadas de pacientes primários para apoptose induzida por ligadura do receptor da morte ou drogas citotóxicas (Fulda et al., 2002). É importante ressaltar que os peptídeos de Smac até mesmo aumentaram a atividade antitumoral do TRAIL in vivo em um modelo de glioma xenograft maligno intracraniano (Fulda et al., 2002b). Da mesma forma, um peptídeo de 8-mer (AVPIAQKS) fundido ao domínio de transdução de proteínas da penetratina antennapaedia Drosophila foi capaz de entrar nas células cancerosas da mama, ligar XIAP e cIAP1, e potencializar a atividade caspase induzida por uma série de drogas anticancerígenas, incluindo paclitaxel, etoposídeo, 7-etil-10-hidroxicamptotecina (SN-38) e doxorubicina (Arnt et al., 2002). Além disso, com base na estrutura tridimensional do Smac/DIABLO em complexo com XIAP BIR3, foram desenhados peptidomiméticos de Smac, que cooperaram com TRAIL, TNFα, cisplatina ou etoposídeo para desencadear apoptose em células tumorais (Li et al., 2004; Sun et al., 2004a, 2004b, 2005).

Subseqüentemente, antagonistas de pequenas moléculas não-peptidicas do XIAP, que foram derivadas pela triagem de uma biblioteca de fagos ou de polifenilureias, foram desenvolvidas para visar os IAPs (Schimmer et al., 2004; Wang et al., 2004). Além disso, o produto natural embelina da erva japonesa Ardisia foi recentemente descoberto como um inibidor de peso molecular pequeno, não péptido e permeável às células da XIAP através da triagem computacional baseada na estrutura de uma base de dados tridimensional da medicina tradicional à base de plantas (Nikolovska-Coleska et al., 2004). Foi demonstrado que a Embelin superou eficazmente o efeito protector da XIAP em células cancerosas da próstata com altos níveis endógenos de XIAP ou em células de Jurkat transfectadas com XIAP através da ligação ao domínio XIAP BIR3 (Nikolovska-Coleska et al., 2004). Assim, os agonistas de Smac ou antagonistas de baixo peso molecular da XIAP podem ser candidatos promissores à terapia do câncer, potencializando a eficácia das terapias citotóxicas seletivamente em células cancerígenas.